Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/18475
Título: Validation of candidate genes for resistance to Phytophthora cinnamomi in progenies of controlled crosses between Castanea sativa and Castanea crenata
Autor: Duarte, Ana Sofia da Silva, 1990-
Orientador: Seabra, Rita Maria Lourenço da Costa, 1960-
Pesquita, Cátia, 1980-
Palavras-chave: Pragas
Castanheiro
Genética molecular
Teses de mestrado - 2015
Data de Defesa: 2015
Resumo: A doença da tinta tem dizimado milhares de hectares de soutos na Europa desde o século XX, o que conduziu a um decréscimo na produtividade de madeira e castanha. O agente causador desta doença é um oomiceta, Phytophthora cinnamomi Rands, que possui formas de sobrevivência e disseminação, permitindo-lhe persistir nos solos. Quando as condições de humidade e temperatura são favoráveis, são produzidos zoósporos que se movimentam através da água e são conduzidos até às raízes não-lenhificadas. A infecção propaga-se até ao câmbio e floema que evolui para necrose das raízes. Na parte aérea da planta, os primeiros sintomas manifestam-se já numa fase mais avançada da doença. A presença de folhas de menores dimensões, amarelecidas e dessecadas, frutos de pequenas dimensões e a presença de um exsudado escuro são sintomas característicos da doença. O oomiceta está distribuído mundialmente e abrange mais de 950 hospedeiros, sendo, por isso, difícil controlar a sua dispersão. O castanheiro europeu, Castanea sativa Mill. é sensível à doença, no entanto, as espécies asiáticas, Castanea crenata e Castanea mollissima conseguem sobreviver em solos infectados. Com objectivo em reduzir as perdas, foram implementados programas de melhoramento do castanheiro. Através de sucessivos cruzamentos controlados entre as espécies asiáticas resistentes e a espécie europeia é teoricamente possível introduzir genes de resistência à doença. A obtenção de híbridos por este método e a sua utilização como porta-enxertos contribuiu para o melhoramento da compatibilidade em ensaios de enxertia com variedades nacionais, mantendo as características da qualidade da madeira e fruto do castanheiro europeu. No entanto, os genes que conferem resistência à doença da tinta e os seus mecanismos moleculares associados não foram ainda caracterizados. Sabe-se que as plantas desenvolveram mecanismos de defesa distintos em resposta a patogéneos. O primeiro baseia-se na detecção de elicitadores secretados pelo patogéneo que promovem alterações conformacionais e transdução de sinal conduzindo a uma resposta hipersensível, fortalecimento da parede celular em tecidos não infectados e morte celular no local da infecção. O segundo mecanismo baseia-se no reconhecimento de efectores através de genes de resistência denominados por genes R, que também levam à activação da transdução de sinal via MAPK e uma resposta hipersensível. Desta forma é possível restringir o crescimento de patogéneos biotróficos. No entanto, Phytophthora cinnamomi é hemibiotrófica, ou seja, tem capacidade de alternar o modo de obtenção de nutrientes para fases de necrotrofia e assim garantir a sua sobrevivência a partir de tecidos vegetais em necrose. Sabe-se que a biossíntese de ácido salicílico, assim como as interacções de outras hormonas como o ácido jasmónico, auxinas, ácido abcísico e etileno estão relacionadas com a modulação da resposta de defesa a patogéneos hemibiotróficos. A activação dos dois mecanismos induz uma resistência sistémica que é conhecida por Resistência Sistémica Adquirida. Em subsequentes infecções verifica-se a redução dos sintomas da doença, devido à expressão de genes de defesa e acumulação de proteínas relacionadas com a patogénese, proteínas PR que dependem da acumulação de ácido salicílico. As interacções entre os três mecanismos de sinalização, a regulação e obtenção de resistência a Phytophthora cinnamomi ainda não foram caracterizados. Foi recentemente iniciada uma abordagem transcriptómica, com objectivo em compreender a expressão diferencial de genes em C.sativa e C.crenata após inoculação com Phytophthora cinnamomi, tendo-se obtido a sequenciação de quatro bibliotecas de cDNA através da plataforma 454. Através da comparação das bibliotecas de C.crenata inoculado e não inoculado foram identificados 283 genes diferencialmente expressos. Este trabalho tem como principal objectivo a selecção de genes de resistência nessas sequências, e ulterior validação, através da sua quantificação por PCR digital contribuindo assim para a caracterização das interacções moleculares existentes no sistema Castanheiro-Phytophthora cinnamomi. Foram desenhados primers para vinte genes diferencialmente expressos, que por análise de homologia funcional, revelaram estar envolvidos no reconhecimento e regulação da resposta do hospedeiro, regulação da resposta à seca e stress hídrico, fortalecimento da parede celular, síntese de enzimas e metabolitos com propriedades anti-fúngicas. Para o estudo foram seleccionadas e produzidas por micropropagação, cinquenta e quatro plantas provenientes de sete genótipos por apresentarem diferentes níveis de resistência. Para representar os extremos de sensibilidade e resistência foi seleccionado um genótipo de C.sativa e outro de C.crenata respectivamente e ainda quatro híbridos com níveis intermédios de resistência, provenientes de cruzamentos entre C.sativa e C.crenata, e um híbrido resistente proveniente do cruzamento entre C.sativa x C.mollissima. Três réplicas biológicas, ou seja, plantas do mesmo genótipo que apresentavam desenvolvimento radicular e condições fisiológicas semelhantes 80 dias após a fase de aclimatação foram inoculadas com Phytophthora cinnamomi. As raízes inoculadas foram recolhidas às 24 ou 48 horas após a inoculação. Foram ainda recolhidas doze raízes não inoculadas provenientes dos genótipos C.sativa e C.crenata, que foram utilizadas como controlo. Procedeu-se à extracção de RNA e após o tratamento com DNase, verificou-se a existência de degradação em algumas amostras. Constatou-se que o desenvolvimento das raízes poderá não ter sido adequado à extracção de grandes quantidades de RNA com boa qualidade e por não ser possível obter novas plantas micropropagadas e aclimatadas, procedeu-se à concentração das amostras e síntese de cDNA. A especificidade dos primers foi avaliada através da análise das curvas de dissociação obtidas por PCR em tempo real. Dezassete pares de primers revelaram ser específicos para os genes seleccionados. Para a quantificação numa primeira abordagem, seleccionaram-se oito genes envolvidos em diferentes níveis de regulação da defesa. WRKY transcription factor 31 envolvido na transdução de sinal em resposta aos níveis de auxinas. RING finger protein 5 que em presença de elicitadores regula a resposta hipersensível e morte celular programada. Ethylene-responsive transcription factor ABR1 regula negativamente a via do ácido abscísico, que quando acumulado conduz ao decréscimo do potencial hídrico, da condutância estomática e da taxa fotossintética. Mybrelated protein Myb4 contribui para a produção de lenhina e fitoalexinas que impedem a colonização do patogéneo. C2 domain-containing protein envolvida na transdução de sinal após a percepção do agente patogéneo e mecanismos de morte celular programada. Cysteine-rich repeat secretory protein 38 (Gnk) apresenta homologia a uma proteína secretada pelas sementes de Gingko e a indução está relacionada com a acumulação de ácido salicílico e espécies reactivas de oxigénio. As proteínas citoplasmáticas com domínios NBS-LRR (LRR receptor-like serine/threonine-protein kinase) participam na detecção e reconhecimento do patogéneo, tendo grande afinidade para efectores do patogéneo e representam uma família importante de genes de resistência. A enzima Pectinesterase 2 catalisa uma reacção de de-esterificação da pectina e possibilita que iões de cálcio se intercalem fortalecendo as paredes celulares e impedindo a colonização. A expressão foi analisada por PCR digital, com o sistema QuantStudio™ 3D Digital PCR (Life Technologies, Carlsbad, CA). Esta é uma técnica recente e inovadora, que se baseia na partição da amostra em 20.000 reacções individuais contidas num chip, possibilitando uma quantificação absoluta e por isso, não necessita de genes de referência. O software permite fazer a análise das três réplicas biológicas em conjunto e assim comparar os valores dos rácios de fold change obtidos por esta técnica com os resultados obtidos pela plataforma 454. A precisão dos resultados de quantificação de cada genótipo foi comprometida pela qualidade das amostras individuais, tendo-se verificado um maior número de cópias nos genótipos para os quais as amostras de RNA correspondentes têm rácios de A260/A280 e A260/A230 superiores a 1,5 e 1 respectivamente. A análise separada das amostras com RNA de melhor qualidade revelou que os genes RING finger protein 5, Ethylene-responsive transcription factor ABR1 e Cysteine-rich repeat secretory protein 38 (Gnk) apresentam níveis de expressão mais elevados nos genótipos mais resistentes. Estes genes poderão ter um papel importante no mecanismo de resistência, sugerindo o envolvimento das vias de sinalização do etileno e ácido salicílico deste modo, novos ensaios deverão ser desenvolvidos futuramente.
Ink disease is responsible for severe losses and poses a serious threat for European chestnut (Castanea sativa) populations. Phytophthora cinnamomi is a widely distributed oomycete that persists on soil or infected plants and penetrates non-lignified root tissues causing the decline and death of chestnut trees. Asian species revealed to be resistant in the presence of pathogen. As it is difficult to control effectively and limit the spread of the disease, the establishment of breeding programs with these species allowed the introgression of resistance genes and development of hybrids with different levels of resistance and improved grafting compatibility. Genes and mechanisms underlying resistance remain to be disclosed. The comparison of inoculated and non-inoculated C.crenata cDNA libraries obtained by 454 sequencing revealed the presence of 283 differentially expressed genes. To provide the first insights into Chestnut-Phytophthora interactions, this study involved the production of fifty-four chestnut plants by micropropagation techniques: C.sativa, C.crenata, one C.sativa x C.mollissima and four C.sativa x C.crenata hybrids with different levels of resistance to P.cinnamomi. RNA was extracted from inoculated roots collected at 24 and 48 hours post-infection and noninoculated control plants. Primers were designed from twenty DEG sequences selected as strong candidates for resistance by homology and functional annotation analysis. Transcript abundance levels of eight candidate genes coding for C2 domain-containing protein, WRKY transcription factor 31, Cysteine-rich repeat secretory protein 38 (Gnk), Ethylene-responsive transcription factor ABR1, Myb-related protein Myb4, LRR receptor-like serine/threonineprotein kinase, RING finger protein 5 and Pectinesterase 2 was assessed by digital PCR. Gene expression accuracy was compromised by RNA quality and it was not possible to obtain conclusive results regarding their role in resistance mechanisms. However, in resistant genotypes, when only the best quality were selected, RING finger protein 5, Ethylene-responsive transcription factor ABR1 and Cysteine-rich repeat secretory protein 38 (Gnk) revealed higher levels of expression, suggesting that ethylene and salicylic acid pathways may be involved in resistance. Transcript abundance levels for these genes should be investigated in more detail in the future.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015
URI: http://hdl.handle.net/10451/18475
Designação: Mestrado em Biologia (Biologia Molecular e Genética)
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