Measles virus : early infection, progression and pathogenesis in a transgenic mouse model

Abstract

O desenvolvimento de novas terapias, de vacinas e a aplicação dos vírus no tratamento do cancro será melhor sucedido quanto mais abrangente e aprofundado for o conhecimento da interacção entre o vírus e o hospedeiro. Esta tese tem como objectivo global compreender a interacção entre o vírus do sarampo e o hospedeiro e as consequências dessa interacção no tropismo e patogénese viral. Em particular, pretende-se identificar as células alvo iniciais do vírus bem como as células responsáveis pela disseminação do vírus no hospedeiro. Pretende-se ainda compreender os mecanismos de atenuação do vírus atenuado do sarampo. O vírus do sarampo é transmitido através de aerossóis e, apesar da infecção ter início no aparelho respiratório, as células alvo iniciais do vírus não são conhecidas. A partir do aparelho respiratório o vírus alcança os orgãos linfáticos e inicia a replicação nos nódulos linfaticos que drenam o aparelho respiratório. Apesar de vários estudos terem sido desenvolvidos, a contribuição da interacção entre os receptores e o vírus no tropismo viral e progressão da infecção têm sido restringidos pela falta de um modelo animal adequado. Os macacos são os únicos primatas não humanos que mostram susceptibilidade ao vírus do sarampo. No entanto, o seu uso fica muito limitado devido a questoes éticas e monetárias. O vírus wild type do sarampo utiliza como receptor celular uma proteína expressa em células activadas do sistema imune denominada de molécula de sinalização de activação linfocitária (SLAM, CD150). Com o objectivo de desenvolver um modelo animal para o estudo da infecção pelo vírus do sarampo, ratinhos transgénicos SLAMGe, ratinhos que expressam o SLAM humano (hSLAM), foram cruzados com ratinhos que apresentam inactivação do gene que codifica para o receptor do interferão tipo I, ratinhos Ifnarko, de forma a permitir uma replicação do vírus mais eficiente. Os ratinhos resultantes do cruzamento foram denominados ratinhos Ifnarko-SLAMGe. São deficientes na produção de interferão tipo I e expressam hSLAM com um perfil de expressão idêntico ao dos humanos. Estes ratinhos foram utilizados neste estudo para caracterizar as células infectadas pelo vírus do sarampo imediatamente após infecção respiratória bem como as células responsáveis pela progressão e disseminação do vírus no hospedeiro. Em primeiro lugar caracterizamos a expressão do hSLAM nos ratinhos Ifnarko-SLAMGe. A expressão de hSLAM foi detectada em linfócitos B e T extraídos do baço e em macrófagos produzidos a partir da medula óssea, através de citometria de fluxo, após activação destas células ex vivo. Uma vez que o linfonodo mediastinal foi previamente demonstrado ser relevante na infecção pelo vírus do sarampo em ratinhos SLAM, estudamos a expressão de hSLAM em células imunes provenientes do linfonodo mediastinal de ratinhos Ifnarko-SLAMGe. Através de citometria de fluxo demonstramos que os linfócitos B e T não activados provenientes do linfonodo mediastinal expressavam baixos níveis de hSLAM. Documentamos ainda que, mais células B do que células T expressavam hSLAM, como previamente demonstrado em tecidos linfáticos humanos. Uma vez que SLAM é expresso em células imunes e não em células epiteliais, as células imunes presentes nas vias respiratórias são candidatas a células alvo para a replicação do vírus. Desta forma, analizamos a expressão de hSLAM em células imunes provenientes dos pulmões do ratinho Ifnarko-SLAMGe. Cerca de 9% de células B e 3% de células T expressavam hSLAM nos pulmões do ratinho Ifnarko-SLAMGe e baixa percentagem de macrófagos alveolares expressavam hSLAM. De seguida, estes ratinhos foram inoculados via intranasal (IN) com o vírus do sarampo wild type. Um vírus derivado da estírpe Ichinoise B e ao qual foi adicionado o gene que codifica para a expressão da proteína verde fluorescente, wtMVgreen. Vários orgãos foram recolhidos um, dois e três dias após a inoculação e analizados para a expressão de proteína fluorescente. Um dia após inoculação a replicação viral foi detectada nos pulmões, e, de seguida, em vários orgãos do sistema linfático; inicialmente no linfonodo que drena o aparelho respiratório, o linfonodo mediatinal, e mais tarde em outros orgãos linfáticos, nomeadamente nos linfonodos mandibular, inguinal e mesentérico, no baço e em células mononucleares do sangue periférico. Para responder à questão quais as células que sustentam a replicação do vírus imediatamente após inoculação, os ratinhos foram inoculados via IN com wtMVgreen; os pulmões e vários orgãos linfáticos foram recolhidos e as células infectadas foram identificadas pela expressão de proteína verde fluorescente através de citometria de fluxo. Os macrófagos alveolares foram identificados como as principais células que sustêm a replicação do vírus do sarampo imediatamente após inoculação respiratória. As células dendríticas foram 5 vezes menos infectadas. Outras populações de células imunes foram infectadas em menor extensão. Apesar da expressão de SLAM pelos macrófagos alveolares ser muito reduzida, 24 horas apos a infecção a expressão de SLAM aumentou drasticamente; 0.86% de macrófagos alveolares expressava SLAM antes da infecção, passando 16% a expressarem SLAM após a infecção. Este resultado sugere que o vírus do sarampo utiliza um receptor celular que é facilmente induzido nas células alvo, contribuindo assim para uma rápida e eficiente disseminação no hospedeiro. Dois dias após a inoculação IN o vírus propagou-se ao sistema linfático sendo o linfonodo mediastinal o primeiro orgão linfático a ser infectado e o que suportou título viral mais elevado. Através de citometria de fluxo identificaram-se os linfócitos B e T como as principais células infectadas bem como células dendríticas, pese embora em menor grau. Por último, com o objectivo de compreender os mecanismos de atenuação da estírpe do vírus usada como vacina do sarampo, foi caracterizada a infecção e disseminação do vírus do sarampo atenuado, denominado aqui de MVvac. Ratinhos Ifnarko-SLAMGe foram inoculados com MVvac pela via de infecção intraperitoneal (IP) e o título viral foi determinado em vários orgãos linfáticos (nomeadamente nos linfonodos mandibular, mediastinal, mesentérico e inguinal e no baço). A replicação do vírus atenuado nos orgãos do ratinho foi muito baixa comparada com a replicação do wild type. Três dias após inoculação, o orgão que apresentou um título viral mais elevado foi o linfonodo mediastinal seguido do linfonodo mesentérico e do baço. A replicação nos linfonodos mandibular e inguinal ficou aquém do limite de detecção. Apesar de o linfonodo mediastinal ser o orgão linfático onde o vírus mais eficientemente se replicou a replicação neste linfonodo pelo MVvac foi cerca de 100 vezes inferior à replicação pelo vírus wild type. De seguida, as células que sustentam a replicação deste vírus bem como do wild type foram identificadas. Um e três dias após a infecção, o linfonodo mediastinal e o baço foram recolhidos e secções destes orgãos foram analisadas através de microscopia confocal. Um dia após inoculação, ambos os vírus infectaram uma população de macrófagos presente na região subcapsular dos linfonodo e na zona marginal do baço, denominados macrófagos do seio subcapsular (macrófagos SSC). Após uma primeira interacção com os macrófagos, foi observada uma disseminação generalizada do vírus do wild type nos folículos do linfonodo bem como na polpa branca do baço. Em contraste, quando os ratinhos foram inoculados com um vírus do sarampo atenuado, apesar de o vírus ser encontrado na região subcaspular do linfonodo e zona marginal do baço no primeiro dia após infecção, colocalizando com os macrófagos SSC, esta infecção inicial não foi seguida de infecção massiva das células linfáticas nestes orgãos. O vírus foi eliminado, observando-se apenas alguma replicação no linfonodo mediastinal e baço mas inferior à replicação pelo wild type. Ainda com o objectivo de esclarecer o mecanismo de atenuação do vírus do sarampo atenuado caracterizamos a replicação de um virus wild type com uma substitução de um aminoácido na proteína hemaglutinina. Esta mutação, asparagina por tirosina, no aminoácido 481 na proteína hemaglutinina (N481Y), está presente em todas as estirpes atenuadas do vírus do sarampo mas não no vírus wild type. Esta substituição introduzida no genoma do vírus wild type permite ao vírus, que apenas usa o SLAM como receptor celular, passar também a utilizar o receptor CD46. O receptor CD46 ou cofactor proteico membranar (MCP) é expresso em todas as células nucleadas do corpo humano. Todas estirpes atenuadas do vírus do sarampo para além de SLAM utilizam o CD46 como receptor celular. Para aceitar ou revogar a hipótese de que esta mutação presente no vírus atenuado pode afectar o fitness do vírus, introduzimos esta mutação num vírus wild type, denominado aqui wtMVN481Y e comparamos a replicação in vivo deste vírus com um vírus wild type original, wtMV. Para tal, ratinhos Ifnarko-SLAMGe forma inoculados via IP com wtMVN481Y ou wtMV. Três dias após inoculação, o título do vírus foi determinado em vários linfonodos e no baço. Demonstramos que esta mutação não afecta a replicação nem o tropismo do vírus uma vez que não se verificaram diferenças relevantes na replicação dos vírus nos diferentes orgãos. De seguida, para compreender se a interacção com o receptor CD46 para além do SLAM afecta a replicação e disseminação do vírus, obtivemos ratinhos transgénicos que expressam o CD46 humano (hCD46) para além do hSLAM, aqui denominados de ratinhos Ifnarko-CD46Ge SLAMGe. Inoculamos ratinhos Ifnarko-CD46Ge-SLAMGe e ratinhos Ifnarko- SLAMGe com o vírus wtMVN481Y e comparamos a replicação e disseminação deste vírus em vários orgãos linfáticos destes ratinhos. Não foram encontradas diferenças significativas na replicação e tropismo deste vírus o que sugere que o uso do receptor CD46 é pouco relevante na atenuação do vírus do sarampo. Este estudo demonstra que os macrófagos e as células dendríticas são as células alvo iniciais do vírus do sarampo e que podem estar envolvidas na rápida disseminação do vírus para outras células imunes no organismo. Demonstra-se ainda que, os macrófagos como células alvo iniciais, aliado à baixa replicação do vírus do sarampo atenuado parecem desempenhar um papel importante na atenuação deste vírus. O uso do receptor CD46 parece ser pouco relevante no mecanismo de atenuação do vírus. Para além disso, a linha de ratinhos transgénicos que expressam o receptor hSLAM são uma peça chave no estudo das fases iniciais de infecção do vírus do sarampo.

Measles virus (MV) is one of the most infectious viruses but several aspects of MV biology and pathogenesis remain poorly understood. The virus is transmitted by aerosol droplets and initial infection is believed to occur in the upper airways but the cells that support early infection and viral spread throughout the body are not well defined. As wild type MV (wtMV) enters cells through SLAM but not CD46 receptor, we generated a transgenic mice expressing human SLAM (hSLAM) and used these mice to identify the cells supporting primary MV infection. We first characterized hSLAM expression in immune cells of these mice by flow cytometry. We documented hSLAM expression in resting B and T cells in the mediastinal lymph node (LN) and in B and T cells and in a small fraction of alveolar macrophages (AM) collected from the lungs. Next, we inoculated these animals intranasally and assessed viral infection in the nasal associated lymphoid tissue, lungs, several LN, spleen and thymus. One day post inoculation (p.i.), viral replication was documented in the lungs; the AM and dendritic cells (DC) were the main infected cells. It was observed that MV infection temporarily enhanced hSLAM expression in AM. From the lungs, infection spread to all lymphatic organs and in particular to the mediastinal LN. This LN supported high levels of infection upon IN and intraperitoneal inoculation. Finally, to understand the mechanisms of MV vaccine attenuation, we compared the spread of wtMV with that of a vaccine strain (MVvac) in Ifnarko-SLAM mice. One day p.i. MV was detected in the subcapsular macrophages in the mediastinal LN. Three days later, the wtMV spread to hSLAM expressing leukocytes whereas the MVvac was cleared. As the wtMV does not enter cells through CD46 receptor but the attenuated strain does, we compared the replication of a wtMV carrying a mutation in the hemagglutinin protein allowing CD46 usage. CD46 usage seems to have no relevant effect on MV attenuation. Thus, SLAM expressing mice allowed characterization of the early steps of MV infection. The alveolar macrophages and dendritic cells are the key players in MV infection and propagation.