Identification of splicing factors with a role in IL-1β secretion

Abstract

Inflammation was one of the first immune responses to be reported to exist and has been a focus of intensive research ever since (reviewed in Rocha e Silva, 1978; Medzhitov, 2010). During the course of an inflammatory response several components are involved, such as inflammatory inducers and mediators or different sensors that mediate the detection of a pro-inflammatory stimulus. Amongst the most studied pro-inflammatory mediators is the Interleukin-1β (IL- 1β). Interleukin-1β was one of the first Interleukins to be identified and represents one of the most important mediators of Inflammation and host responses to infection (reviewed in Dinarello, 2004). The large connection between misregulation of IL-1β release and the appearance of inflammatory diseases made this cytokine one of the “hotspots” of intensive research in the past years (reviewed in O'Neill, 2008). Nowadays, several diseases are being treated successfully using different methods that decrease IL-1β circulant levels or block its effects, such as using IL-1β receptor antagonists or by neutralizing IL-1β with monoclonal anti-IL- 1β antibodies (reviewed in Fitzgerald et al., 2005; Kalliolias et al., 2008; Lequerre et al., 2008; Martinon et al., 2009). The IL-1β secretion pathway is a “two-step” fashion mechanism, Production and Processing steps. The cytokine is produced in an inactive pro-form (pro-IL-1mainly upon activation of the nuclear factor-kB (NF-kB) transcription factor and posterior translation into protein. The second and processing step is mediated by active Caspase-1, that will give rise to its mature and secreted form (reviewed in Martinon et al., 2009). Caspase-1 is also synthesized as an inactive form that requires processing by the Inflammasome complex to become active (reviewed in Martinon et al., 2009). Upon Inflammasome formation, Caspase-1 becomes active, leading to subsequent IL-1β processing and posterior release. However, despite the increase knowledge that has been obtained during the past years, a lot still remains to be unveiled concerning the mechanisms involved in the regulation of IL-1β secretion and the effects elicited by this cytokine. Several genes involved in the regulation of IL-1β secretion were shown to be regulated by Alternative Splicing (AS), such as MyD88, IRAK2 and NOD2, among others (reviewed in Leeman et al., 2008). Moreover, the increasing number of cellular processes regulated by AS and the strong correlation between defects in Splicing and disease (reviewed in Leeman et al., 2008; Tazi et al., 2008), strongly suggest that AS may play a role in the initiation and regulation of an inflammatory response, particularly in the secretion of the pro-inflammatory cytokine IL-1β. In an attempt to identify the Splicing Factors and Regulators (SF) with a potential role in the secretion of IL-1β upon an inflammatory stimulus, we performed an RNAi-based screen. Briefly, we used a subset of the TRC Lentiviral Human Library to generate loss-of-function phenotypes for most of SFs. We silenced the expression of 425 genes involved in Splicing with an average 5-fold coverage. After the primary screen and several rounds of phenotypic validation, 19 genes were identified to significantly affect the secretion of IL-1by THP-1 cells after a 24 hours challenge with E. coli, as measured by ELISA. Among the candidates, ASF/SF2 and SRp20, showed a clear negative regulator phenotype, where upon decreased expression of these two candidates, elevated levels of secreted IL-1β secretion were detected, in comparison to control. Thus, we decided to focus our attention in these two SFs. In order to confirm the phenotype observed using the RNAi technology, we overexpressed these two candidates in THP-1 cells. As expected, overexpression decreased the levels of secreted IL-1β, therefore validating the previous results as implicating ASF/SF2 and SRp20 as negative regulators of IL-1β secretion. In addition, using drugs already described to block the Splicing dependant on ASF/SF2 or SRp20, we observed increased levels of IL- 1β upon treatment, therefore, once more confirming the results obtained in the RNAi based screen. Next, we studied the role of ASF/SF2 and SRp20 in the regulation of the two-steps necessary for IL-1β secretion. The levels of IL-1β mRNA expression were increased upon ASF/SF2 or SRp20 knockdown, when compared to control cells. We could then conclude that both SFs are negative regulators of IL-1β production. As mentioned before, the second step necessary for IL-1β secretion is its processing in a Caspase-1 dependant manner. We measured Caspase-1 activation by FACS in cells upon ASF/SF2 or SRp20 knockdown and posterior challenge with E.coli. Knocking-down ASF/SF2 did not show any impact in Caspase-1 activation. In opposition, a remarkable increase in Caspase-1 activation was observed upon SRp20 knockdown, as compared to control cells. Thus, we could conclude that SRp20 acts as a negative regulator of both IL-1β Production and Processing, whereas ASF/SF2 is a negative regulator of IL-1β Production. In addition, increased Caspase-1 mRNA expression was observed in SRp20 knockdown cells as compared to control, consequently suggesting that increased Caspase-1 activation in SRp20 knockdown cells might be due to increased Caspase-1 expression. However further experiments are still required to prove this assumption. In the past years, several reports clearly show the involvement of these two SFs in the regulation of different cellular processes such as transcription, translation and apoptosis (reviewed in Huang et al., 2004; Li et al., 2005a; Long et al., 2009). A recent report implicates ASF/SF2 in Inflammation (Xiong, 2006), as it was shown that ASF/SF2 is downregulated in inflamed muscle or after an inflammatory stimulus, such as TNF. Thus, we decided to check the expression of ASF/SF2 and SRp20 upon E.coli challenge. Decreased expression of ASF/SF2 was observed at the mRNA level, whereas decreased expression of SRp20 was only observed at the protein level after an E.coli challenge. The mechanisms involved in the downregulation of these two SFs upon E.coli challenge are now being investigated. The increased number of genes that are regulated by AS already reported to play a role in Inflammation strongly suggested us to look for their Splicing profiles in ASF/SF2 or SRp20 knockdown cells upon an E.coli challenge. Several PCR experiments were performed to identify differences in the Splicing patterns of the described genes, however with no conclusive results. Consequently, we decided to perform an unbiased and high-throughput analysis of Alternative Splicing Events (ASE) that take place either after an E.coli challenge or after knockdown of ASF/SF2, using the Affymetrix® GeneChip® Human Exon 1.0 ST Arrays platform. Upon data analysis and validation, several genes already reported to undergo AS in different publications were found using our approach, therefore validating our method. We are now focusing on the most relevant candidates to perform follow-up studies. In sum, this work allowed us to identify two novel regulators of IL-1β secretion after an E.coli challenge. Our results clearly show that both ASF/SF2 and SRp20 are negative regulators of IL-1β secretion. While SRp20 is involved in the regulation of the two-steps required of IL-1β secretion, Production and Processing, ASF/SF2 is only involved in the regulation of the first step, Production. In addition to IL-1β, increased Caspase-1 expression was also observed upon SRp20 knockdown, suggesting the involvement of this SF in the regulation of the expression of this inflammatory Caspase. Moreover, the expression of the two SFs was also shown to be altered in the course of an inflammatory response to E.coli challenge, however the mechanism involved has yet to be determined. Several studies are now required to determine the mechanisms by which these two SFs play a role in IL-1β Secretion.

A descrição dos quatro sinais de Inflamação (rubor, calor, tumor e dor) por Celsus retrata talvez pela primeira vez a existência desta resposta Imune (revisto por Rocha e Silva, 1978). Durante muito tempo, como descrito por Metchnikoff em 1892, julgava-se necessária a presença de um micróbio para a indução de Inflamação, no entanto, sabe-se actualmente que a sua presença não é necessária para que o processo de Inflamação ocorra, sendo cada vez mais observadas respostas inflamatórias na sua ausência (revisto por Metchnikoff, 1892; Dinarello, 2004; Medzhitov, 2008). Ao longo dos últimos anos, têm surgido novas áreas de investigação com a finalidade de estudar o complexo mecanismo de regulação da resposta inflamatória. Alguns dos grandes marcos que originaram mudanças significativas na compreensão do mecanismo de Inflamação foram (1) a descoberta da secreção de mediadores pró-inflamatórios por parte das células do Sistema Imune (como por exemplo, as Interleucinas 1β (IL-1β) e 8 (IL-8), Menkin, 1944; Dinarello, 2009), (2) a definição de “Pattern Recognition Receptors” (Janeway, 1989), como receptores envolvidos no reconhecimento de diversas estruturas conservadas presentes em diversos micróbios ou mediadores de sinalização celular; e (3) a descoberta do Inflamassoma, um complexo multiproteico envolvido no processamento de diversas Interleucinas, incluindo a IL-1(Martinon et al., 2002). Com a melhoria dos conhecimentos relativos ao mecanismo de regulação da resposta inflamatória, foi possível associar mutações em componentes-chave desta resposta a um elevado número de doenças, como é o caso do Síndrome de Muckle-Wells ou a Febre Mediterrânica Familiar, mutações ao nível do NALP3 ou Pyrin, respectivamente (Ogura et al., 2001; Maeda et al., 2005; McGonagle et al. 2007; Church et al. 2008; Martinon et al., 2009). No que respeita às citocinas pró-inflamatórias, a IL-1β foi uma das primeiras Interleucinas a ser identificada e representa um dos mais importantes mediadores da Inflamação e da resposta do hospedeiro à infecção (revisto por Dinarello, 2004). A elevada correlação entre defeitos na regulação da secreção desta citocina e o aparecimento de doenças inflamatórias, fez desta um dos focos de maior investigação na área da Inflamação nos últimos anos (revisto por O'Neill, 2008). Actualmente, várias doenças são já tratadas com sucesso, quer com antagonistas do receptor de IL-1β, como por exemplo usando o antagonista Anankira, quer com outros métodos que visam diminuir a concentração de IL-1β, recorrendo, por exemplo, à neutralização de IL-1β com o recurso a anticorpos monoclonais anti-IL-1β (revisto em Fitzgerald et al ., 2005; Kalliolias et al., 2008; Lequerre et al. 2008; Martinon et al., 2009). O processo que leva à secreção da IL-1β ocorre essencialmente em dois passos fundamentais, a Produção e o Processamento. Esta citocina é produzida numa pró-forma inactiva (pro-IL-1), sendo maioritariamente transcrita após a activação do factor de transcrição “Nuclear Factor-kB” (NF-kB) e seguidamente traduzida em proteína. Posteriormente, esta forma inactiva de IL-1β é processada na sua forma activa, por um mecanismo que envolve a presença da Caspase-1, num passo que precede a sua secreção (revisto por Martinon et al., 2009). Por sua vez, a Caspase-1 é também sintetizada de forma inactiva, que requer processamento pelo complexo multiproteico Inflamassoma para se tornar activa (revisto por Martinon et al., 2009). Em suma, os dois passos que levam à secrecão da IL-1β são a Produção e a Activação do Inflamassoma, que levará à activação da Caspase-1, processamento da IL-1β e subsequente secreção desta. Porém, embora o complexo mecanismo envolvido na regulação da secreção desta citocina tenha vindo a ser amplamente estudado, não é ainda inteiramente conhecido, pelo que é de extrema importância o seu estudo de uma forma mais aprofundada. Com o aumento do conhecimento dos mecanismos envolvidos na regulação da secreção de IL-1β, alguns investigadores têm direccionado agora a sua atenção na pesquisa de como serão reguladas as moléculas envolvidas nesse processo, no decurso de uma resposta inflamatória. Foram identificados diversos níveis de mecanismos de regulação como: diferenças ao nível de expressão, distintos estados de fosforilação, existência de várias isoformas da mesma molécula, entre outros (revisto por Hayden et al., 2004; Lynch, 2004; Anderson, 2010). Foram, também, identificados genes envolvidos na regulação da secreção de IL-1β como sendo regulados por “Splicing” Alternativo (AS), como por exemplo o MyD88, o IRAK2 e o NOD2 (revisto em Leeman et al., 2008). Assim, o aumento do número de funções celulares regulados por AS bem como a forte correlação entre alterações ao nível do “Splicing” e a existência de doença (revisto por Leeman et al., 2008; Tazi et al. 2008), indica que o AS pode desempenhar um papel importante na iniciação e na regulação de uma resposta inflamatória, particularmente na secreção de citocinas pró-inflamatórias como a IL-1β. Na tentativa de identificar os Factores de “Splicing” (SF) que desempenhem um papel na secreção de IL-1β após um estímulo inflamatório, usamos como modelo o estímulo de uma linha celular monocítica (THP-1) com E.coli, na triagem da secreção daquela citocina recorrendo à tecnologia de RNA de interferência (RNAi). Resumidamente, foi utilizada uma sub-colecção da biblioteca de RNAi disponibilizada pelo “The RNAi Consortium” (TRC) que permitiu estudar os efeitos da perda de função de 425 genes envolvidos no mecanismo de “Splicing” durante a produção e secreção de IL-1β. Após o “knockdown” e posterior estimulação com E.coli, os níveis de IL-1β secretados foram medidos por ELISA. Após triagem e sucessivas experiências de validação, foram identificados 19 genes que afectam significativamente a secreção de IL-1β no nosso modelo. Entre os candidatos validados, os factores de Splicing (SF), ASF/SF2 e SRp20 mostraram um fenótipo consistente com o de reguladores negativos, pois após a diminuição da sua expressão usando a técnica de RNAi, detectaram-se níveis elevados de secreção de IL-1β. Seguidamente, reverteu-se o fenótipo observado, por clonagem dos dois SFs e sobre-expressão na mesma linha celular. A sobre-expressão destes SF fez diminuir os níveis de IL-1β secretados, validando os resultados anteriores, e implicando o ASF/SF2 e o SRp20 como reguladores negativos da secreção de IL-1β. Com o aumento de doenças associadas a alterações ao nível de “Splicing”, nalguns estudos são usadas actualmente drogas que controlam a expressão ou actividade de diversos SF, de forma a modular as respostas em questão. Dois desses estudos, efectuados por Stoilov e Keriel (Stoilov et al. 2008; Keriel et al., 2009), identificaram vários compostos capazes de modular eventos de “Splicing” dependentes destes dois SF em estudo. Usando estas mesmas drogas, observou-se um aumento na secreção de IL-1β após o estímulo com E.coli, uma vez mais confirmando os nossos resultados de RNAi. A fim de avaliar o papel dos dois candidatos, ASF/SF2 e SRp20, nos dois passos necessários para a secreção de IL-1β, Produção e Processamento, foram efectuadas várias experiências. Analizaram-se os níveis de expressão de IL-1β por PCR quantitativo após o silenciamento destes dois candidatos e posterior estímulo com E.coli. Foram observados valores de expressão de IL-1β superiores nas células onde a expressão dos dois SF tinha sido anteriormente reduzida por RNAi. Os resultados permitem concluir que ambos os candidatos são reguladores negativos da produção de IL-1β. Como forma de verificar o impacto do “knockdown” dos dois candidatos no segundo passo necessário para a secreção de IL-1β, medimos a actividade da Caspase-1 recorrendo a uma técnica de citometria de fluxo (FACS). O “knockdown” do ASF/SF2 não apresentou qualquer impacto na activação de Caspase-1. Em oposição, observou-se um notável aumento de activação de Caspase-1 após o “knockdown” do SRp20. Com estes resultados pudemos concluir que o SRp20 é um regulador negativo de ambas as etapas necessárias para a secreção de IL-1β, Produção e Processamento, enquanto que o ASF/SF2 é um regulador negativo da produção de IL-1β. Observaram-se também, níveis elevados de expressão de Caspase-1 após o “knockdown” do SRp20, podendo talvez desta forma explicar os níveis superiores de activação de Caspase-1 observados nestas condições. Entre as diversas funções já descritas como sendo mediadas por estes dois SF, um estudo recente implicou o ASF/SF2 no processo inflamatório (Xiong, 2006). Nesse estudo foi demonstrado que a expressão do ASF/SF2 é reduzida em músculo inflamado ou após um estímulo inflamatório (por exemplo usando TNF Xiong, 2006). Decidimos então analisar a expressão dos dois candidatos mediante estimulação com E.coli, no sistema em estudo. Notou-se uma redução da expressão do ASF/SF2 ao nível do mRNA, ao passo que a expressão diminuída do SRp20 foi observada somente ao nível de proteína. Os mecanismos envolvidos neste processo de regulação dos dois SF mediante estimulação com E.coli estão agora a ser investigados. Como supracitado, o aumento do número de genes que são regulados por AS que desempenham um papel na Inflamação precisam ser estudados mais profundamente. Foram inicialmente analisados os perfis de “Splicing” de alguns dos genes anteriormente identificados como sendo regulados por AS e que podem ter um papel activo na regulação da secreção de IL-1β. Foram estudados os padrões de “Splicing” de alguns genes após o “knockdown” do ASF/SF2 ou SRp20 e/ou estimulação com E.coli, porém sem resultados conclusivos. Assim, decidimos realizar uma análise das alterações nos padrões de “Splicing” recorrendo à tecnologia de “microarrays” usando a plataforma Affymetrix® GeneChip ® Human Exon 1.0 ST. Foram analisadas as alterações dos padrões de “Splicing” de todos os genes Humanos após “knockdown” do ASF/SF2 e/ou estimulação com E.coli, ficando o estudo das alterações relativas ao outro candidato, SRp20, para futuras experiências. Após a análise dos dados e respectiva validação, vários dos genes, já anteriormente relatados em diversas publicações como sendo regulados por AS nas mesmas condições, foram encontrados utilizando a nossa abordagem, validando assim o nosso método. No futuro serão efectuados estudos mais detalhados para os genes mais promissores com o intuito de desvendar o seu papel na regulação da secreção de IL-1β. Podemos concluir que a tecnologia de RNAi é uma ferramenta poderosa para desvendar os genes envolvidos em diferentes vias celulares. No nosso estudo, foram identificados vários SF que podem desempenhar um papel na regulação da secreção de IL-1β após um estímulo com E.coli. Entre os candidatos identificados, o ASF/SF2 foi demonstrado como desempenhando papel na primeira etapa da secreção de IL-1β, a Produção; ao passo que o outro candidato estudado, o SRp20, desempenha um papel importante, quer na Produção de IL-1β, quer na etapa de Processamento por parte do Inflamassoma. São necessários vários estudos para determinar os mecanismos pelos quais estes SF desempenham um papel regulador da secreção de IL-1β.