Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/20292
Título: Expression analysis of transcription factors related to the grafting process in Vitis
Autor: Severino, Rita Sofia dos Santos
Orientador: Fevereiro, Pedro, 1959-
Palavras-chave: Enxertos
Vinha
Expressão genética
Transcrição genética
Teses de mestrado - 2015
Data de Defesa: 2015
Resumo: O processo de enxertia consiste na união de duas plantas com genótipos diferentes, o enxerto e o porta-enxerto. Na vinha é utilizado, principalmente, no combate à praga filoxera (Daktulosphaira vitifoliae), de origem norte-americana e introduzida na Europa no século XIX. Apesar da enxertia ser um processo muito antigo, a incompatibilidade entre enxertos, caracterizada pela quebra da planta pela zona da enxertia, é ainda um grave problema, que pode passar despercebido durante anos. Histologicamente, a diferença entre enxertos compatíveis e incompatíveis está bem descrita, sendo principalmente caracterizada pelo grau de desenvolvimento e reunião vascular entre o enxerto e o porta-enxerto, mas este é ainda um processo particularmente desconhecido do ponto de vista molecular e a expressão genética que caracteriza a (in)compatibilidade permanece, em larga escala, desconhecida. No sentido de contribuir para o conhecimento nesta área, considerámos de particular interesse a análise da expressão de factores de transcrição (TFs) envolvidos no processo de compatibilidade da enxertia, uma vez que estes possuem a capacidade de controlar a expressão de numerosos genes, regulando vários processos biológicos, incluindo stress biótico, stress abiótico e desenvolvimento. Com esse objectivo, foram utilizados hetero-enxertos, auto-enxertos e variedades não enxertadas (os dois últimos para controlo) de duas variedades de Touriga Nacional, TN112 (A) e TN21 (B), com diferentes taxas de compatibilidade, e o porta-enxerto Richter-110, previamente testados para despiste de infecção viral. As enxertias foram realizadas utilizando a técnica omega e a amostragem da zona de enxertia foi feita em três fases temporais: fase da calogénese (I - 21 dias), fase de enraizamento (II - 3 meses) e no fim do primeiro ciclo vegetativo (III - 12 meses). Todas as amostras foram lavadas, cortadas, etiquetadas e armazenadas a -80ºC. Para extracção de RNA, foi recolhido o tecido da zona de enxertia de três plantas diferentes, por combinação, num total de 15 amostras, imediatamente congeladas em nitrogénio líquido. O RNA total de cada amostra foi extraído com clorofórmio:ácido isoamílico (24:1) seguindo um protocolo adaptado de Chang et al. (1993) e Le Provost et al. (2007). A concentração total de RNA foi avaliada por espectroscopia UV-Vis (absorvância a 260 nm), usando o espectrofotómetro Nanodrop ND-2000C. A pureza e integridade do RNA foram determinadas pela relação da absorvância a 260/280 nm e visualização após corrida em gel de eletroforese. O DNA genómico contaminante foi removido do RNA com o kit DNA-free Turbo de Ambion® (de acordo com as instruções do fabricante) duas vezes. Amostras de RNA de três repetições biológicas por combinação foram enviados para análise do transcriptoma pelo método de sequenciação MACE (Massive Analysis of cDNA Ends), desenvolvido pela GenXpro GmbH. Foram construídas quatro bibliotecas (AI/AII, BI/BII, AI/BI e AII/BII) com 23999 genes cada, e analisadas no programa Microsoft Excel®, sendo que os níveis de expressão considerados representam a média normalizada dos níveis de expressão em cada grupo de réplicas biológicas. Um total de 466 (bibliotecas A/B) e 3037 (bibliotecas I/II) genes foram seleccionados com base no FDR (FDR <0,5) e na razão da expressão entre grupos (Log2FoldChange). Para as bibliotecas AI/AII e BI/BII foi considerado um Log2FoldChange arbitrário > |1.9|, enquanto que para as bibliotecas AI/BI e AII/BII foi considerado um Log2FoldChange > |1|. Para cada gene foram obtidas as sequências peptídicas em formato FASTA, utilizando o recurso informático Biomart em http://plants.ensembl.org/biomart/, e carregadas no programa Blast2GO em https://www.blast2go.com, onde foi realizada uma pesquisa BLAST utilizando o algoritmo BLASTp (e-value<1e-6). Foram identificados 19 (bibliotecas A/B) e 66 (bibliotecas I/II) genes com actividade de factor de transcrição e regulação da expressão genética. A anotação de cada gene foi confirmada em VTCdb — Vitis co-expression database, e Planttfdb, em http://vtcdb.adelaide.edu.au e http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/, respectivamente. As taxas de sobrevivência foram obtidas no final do ciclo (quando as plantas entraram em fase de dormência) e permitiram identificar a combinação TN21/R110 como o hetero-enxerto mais compatível. No entanto, contrário ao esperado, não foi o auto-enxerto TN21/R110 a apresentar a maior taxa de sobrevivência, mas sim a combinação TN112/R110. Com base na bibliografia existente sugere-se a hipótese de que um evento de transferência horizontal genética (HGT) poderia produzir estes resultados, ao superar a barreira da incompatibilidade genética e sincronizar as respostas de defesa e regeneração entre as células das duas plantas, pelo que seria interessante estudar a ocorrência de HGT em enxertias de Vitis vinifera. Da análise dos vinte genes diferencialmente expressos entre as fases de calogénese e enraizamento pôde-se verificar que, embora não diferencialmente expressos entre enxertias, doze começaram por ser ligeiramente mais expressos na combinação compatível TN21/R110, em particular genes relacionados com as hormonas auxina e giberelina, bem como uma proteína kinase. No geral, é provável que os genes encontrados estejam relacionados com a saída do período de dormência. Comparando hetero-enxertias, observou-se a expressão diferencial de genes pertencentes a cinco famílias: AP2/ERF, WRKY, Zinc Finger do tipo C2H2, NAC e TALE. Cinco genes encontravam-se diferencialmente expressos na fase de calogénese e treze na fase de enraizamento. Não foram encontrados, diferencialmente expressos, genes envolvidos na regulação das hormonas auxina ou citocinina. Na calogénese, foi observada principalmente a expressão de dois genes pertencentes à família AP2/ERF (RAP2.4 e ERF109). De acordo com a bibliografia, estes resultados sugerem uma maior resistência a stress oxidativo no enxerto mais compatível. No enxerto menos compatível, o stress oxidativo poderá ser responsável pela fraca ou inexistente vascularização da zona de enxertia, condição que caracteriza a incompatibilidade. Se a produção inicial de etileno e ROS ou se a capacidade para recuperar a homeostase, ou ambos, são responsáveis na probabilidade de sucesso da enxertia, requer uma investigação mais aprofundada. Na fase de enraizamento, nota-se uma predominância na expressão de TFs relacionados com stress biótico, nomeadamente pertencentes à famíla WRKY. Os resultados são compatíveis com estudos anteriores e sugerem que a combinação menos compatível TN112/R110 poderá ter experienciado um prolongamento do período de defesa, visto a expressão destes genes ser maior nesta combinação. Tal prolongamento pode colocar em risco a regeneração e vascularização. Além disso, este tipo de resposta imunitária pode ser provocada por incompatibilidade genética entre as duas plantas do enxerto, podendo em última análise resultar em apoteose celular. Dada a elevada expressão dos TFs WRKY18 e WRKY70, propomos que estes sejam considerados para marcadores moleculares de incompatibilidade da enxertia.
Grafting is an ancient technique widely used in viticulture mainly as a control tool in grape phylloxera infected soils. Still, graft incompatibility is a problem, specially because it can go undetected for years. Although the histological and biochemical traits of (in)compatibility have been well established, the molecular mechanisms underlying the process are still poorly understood. Because late rejection seems to be predetermined already at the initial steps of union formation, the transcriptome of 21 days (callogenesis) and 3 months (rooting) old graft tissue from two rootstock/scion combinations of Touriga Nacional and Richter-110, with different rates of graft success, was analysed. Interestingly, graft success was higher for the heterograft of one of the Touriga Nacional clones compared to its autograft, and we discuss a possible relation to horizontal gene transfer events. For the most incompatible heterograft, gene expression analysis showed that it was subject to a higher oxidative stress response at callogenesis and a stronger immune-type response at rooting, compared to the most compatible heterograft. As severe oxidative stress and a prolonged immune-type response can arrest the progression of cell division and differentiation, their role in the incomplete and/or disorganized vasculature typically observed in incompatible grafts was discussed. Moreover, results suggest that initial ethylene production at callogenesis is higher in incompatible grafts and its predictive value for graft (in)compatibility is also discussed. Additionally, two strong candidates for incompatibility molecular markers at rooting were identified, namely WRKY18 and WRKY70.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015
URI: http://hdl.handle.net/10451/20292
Designação: Mestrado em Biologia (Biologia Molecular e Genética)
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