Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/20379
Título: Image-guided drug delivery using Fe-deferoxamine loaded temperature-sensitive liposomes
Autor: Fernandes, Adriana Martins
Orientador: Grüll, Holger
Matela, Nuno Miguel de Pinto Lobo e,1978-
Palavras-chave: Lipossomas sensíveis a temperatura
Administração localizada de fármaco
Ultrassom focal de alta intensidade guiado por ressonância magnética
Agentes de contraste
Ferro
Teses de mestrado - 2015
Data de Defesa: 2015
Resumo: A predominância de cancro está a aumentar nos países ocidentais uma vez que a população se encontra cada vez mais envelhecida. A quimioterapia é uma das abordagens mais utilizadas, no entanto, existe a necessidade de aumentar a absorção dos fármacos nos tumores. Um modo com vista a reduzir os efeitos secundários negativos para o paciente é a entrega de fármacos, induzida pela temperatura. Este conceito está relacionado com lipossomas sensíveis à temperatura que encapsulam fármacos que irão atuar como agentes de quimioterapia. Estes fármacos são libertados mediante o aquecimento a temperaturas em torno dos 42 ºC. A esta temperatura a bicamada lipídica experimenta uma transição de fase, o que por sua vez intermedeia uma rápida entrega de fármaco. Uma distribuição localizada do fármaco é conseguida aquecendo a área central do tumor. O conceito acima apresentado foi estendido à entrega localizada de fármacos guiada por imagem, ao encapsular adicionalmente um agente de contraste no lipossoma. Ao encapsular tanto o fármaco, neste caso a doxorubicina, como o agente de contraste, para ressonância magnética à base de gadolinium, é possível quantificar a entrega de fármaco induzida pela temperatura. Uma vez libertado o agente de contraste do lipossoma dá-se uma variação no contraste nas imagens de ressonância magnética, o que possibilita quantificar a dose de fármaco libertado no tumor. A utilização de lipossomas sensíveis à temperatura, que encapsulem tanto doxorubicina como gadolinium (Gd), potenciam a avaliação da eficácia da entrega do fármaco no tumor. A taxa de relaxação longitudinal traduz-se no inverso do tempo de relaxação T1. Os agentes de contraste permitem a redução dos tempos de relaxação característicos da ressonância magnética, melhorando o contraste das imagens, o que permite uma melhor diferenciação das estruturas presentes. Foi demonstrado anteriormente que existe uma boa correlação entre a absorção de fármaco, a concentração do agente de contraste e a taxa de relaxação longitudinal do agente de contraste (R1) no tumor. No entanto, a utilização de lipossomas paramagnéticos, que encapsulem agentes de contraste em ressonância magnética à base de Gd pode conduzir à toxicidade induzida pelo Gd. Isto acontece pois os lipossomas são preferencialmente depurados pelo fígado e baço, o que leva à concentração elevada de Gd3+ nestes órgãos. Em pacientes que sofram de insuficiência renal grave, sabe-se que a retenção prolongada deste agente de contraste à base de Gd pode conduzir a fibrose sistémica nefrogénica. Uma vez que ao encapsular Gd em lipossomas a sua depuração acontece essencialmente no baço e fígado, em oposição à depuração renal (para o Gd quando se encontra na forma livre), o agente de contraste ficará retido mais tempo no organismo o que levanta questões relativamente à segurança deste conceito. Dado este problema, existia a necessidade de encontrar uma alternativa viável para o agente de contraste, Gd, comercialmente conhecido como ProHance®. Um estudo realizado anteriormente no grupo de investigação passou por substituir o Gd, [Gd (HPDO3A) (H2O)], por um agente de contraste à base de ferro, Fe3+-deferoxamine (Fe3+-DFO), pois o ferro tem uma via metabólica estabelecida. Infelizmente, mediante o aquecimento dos lipossomas, localmente, foi observada uma libertação gradual do agente de contraste, Fe3+-DFO, em vez de uma libertação rápida e completa a uma temperatura específica, a temperatura de transição (Tm), como verificado quando se utilizou Gd como agente de contraste. A causa deste comportamento pode dever-se à hidrofobia do agente de contraste Fe-DFO, permitindo que o mesmo atravesse a bicamada ou mesmo uma associação do agente de contraste com a bicamada. Adicionalmente, o encapsulamento tanto do agente de contraste Fe-DFO como do fármaco doxorubicina aboliu o tempo de relaxação T1, possivelmente devido à formação de óxidos de ferro ou agregações de doxorubicina com o ferro. Outro ponto negativo do encapsulamento de Fe-DFO em lipossomas sensíveis à temperatura prende-se com o baixo valor de pH de solução tampão intralipossomal requerido, de modo a possibilitar um encapsulamento estável do complexo dentro do lipossoma. Isto pode levar à hidrólise da bicama limitando assim o tempo de vida do produto resultante. O objetivo deste projeto passou por usar um agente de contraste derivado de Fe3+-deferoxamine, mas mais hidrófilo, deferoxamine-N-succimidyl Fe(III), DFO-N-Suc-Fe (III), assim como uma formulação lipossomal diferente, de modo a resolver o problema observado. Este agente de contraste poderia ser utilizado para monitorizar a libertação de doxorubicina de lipossomas sensíveis a temperatura (TSLs). A aplicação final seria a quantificação da dose de fármaco utilizada na quimioterapia ao utilizar TSLs juntamente com ultrassons focados de alta intensidade guiados por ressonância magnética. Em estudos anteriores já enunciados, ao encapsular tanto a doxorubicina como o Fe3+-DFO em lipossomas a relaxividade foi perdida. Deste modo, em primeiro lugar, ao invés de encapsular os dois compostos num mesmo lipossoma, lipossomas com doxorubicina e lipossomas com agente de contraste serão co injetados. Em segundo lugar, ao variar a formulação lipídica que constitui os lipossomas, tentou-se ajustar a estabilidade e as propriedades de libertação dos lipossomas ao encapsular o agente de contraste. Por fim, o agente de contraste à base de ferro foi adaptado de modo a conseguir um encapsulamento mais estável. As medições da taxa de relaxação longitudinal, R1, em função da temperatura indicaram que a libertação do agente de contraste, DFO-N-Suc-Fe (III), de lipossomas tradicionais sensíveis a temperaturas aconteceu entre 41 ºC e 42 ºC, em contraste com a temperatura a que o agente de contraste Fe-DFO foi libertado do mesmo tipo de lipossomas (entre 42 ºC e 45 ºC). Além disto a libertação do agente de contraste, DFO-N-Suc-Fe (III), foi rápida, ao contrário da libertação do agente de contraste Fe-DFO, que se deu gradualmente. Medições a temperaturas constantes revelaram 100 % de libertação do agente de contraste, DFO-N-Suc-Fe (III), passados 15 minutos e cerca de 80 % de libertação passados apenas 5 minutos. Este tempo de libertação pode ser melhorado ajustando a formulação lipídica. Estes lipossomas revelaram-se muito estáveis à temperatura corporal o que se revelou uma melhoria considerável quando comparados com lipossomas que encapsulavam Fe-DFO. Lipossomas sensíveis à temperatura que encapsulavam o complexo DFO-N-suc-Fe (III) foram adicionalmente diluídos em solução tampão para testes de caraterização in vitro. Os tempos de relaxação longitudinal e transversal T1 e T2, respetivamente, foram medidos num scanner clínico de ressonância magnética de 3 T, antes e depois de aquecer os lipossomas durante 30 minutos, a 45 ºC. Antes de aquecer os lipossomas, diferentes concentrações do complexo DFO-N-suc-Fe (III) assumiram um valor de T1 menor quando comparado com o valor da mesma amostra após o aquecimento. Esta experiência veio mostrar o potencial da imagem de ressonância magnética, quando combinada com lipossomas sensíveis à temperatura. O objetivo desta investigação passou por melhorar a libertação lipossomal do agente de contraste, assim como a estabilidade da formulação lipossomal. Ambas as melhorias, na libertação e estabilidade, foram obtidas através da adaptação do complexo Fe-DFO utilizado inicialmente, o que permitiu um pH intralipossómico mais elevado, minimizando assim o risco de hidrólise. A associação de Fe-DFO com a doxorubicina foi evitada, optando por uma co-injeção em vez de um co-encapsulamento. Os passos seguintes incluem pequenas adaptações à formulação lipídica, numa tentativa de encapsular mais agente de contraste. Quando a formulação estiver completamente aperfeiçoada deverá também ser estudado o mesmo sistema para a doxorubicina. O último passo será a injeção in vivo de modo a quantificar a dose de fármaco administrada no tumor por meio de lipossomas sensíveis à temperatura, utlizado um agente de contraste à base de ferro. Verificando-se eficácia in vivo, esta classe de agentes de contraste criará oportunidades na libertação monitorizada de fármaco com recurso a ressonância magnética, em resposta a hipertermia local, evitando os inconvenientes de agentes de contraste à base de Gd.
The predominance of cancer is rising in western countries since a demographic change in the direction of an aging society is happening. Chemotherapy is one of the standard treatments but there is a need to increase the uptake of drug in tumors. One approach to reduce negative side effects to the patient is temperature-induced drug delivery. This concept regards temperature-sensitive liposomes encapsulating a drug that will act as a chemotherapy agent. This drug will be released upon heating to a mild hyperthermia (around 42 ºC). At this temperature the lipid bilayer experiences a phase transition that will intermediate a fast drug delivery. Local drug delivery can be achieved by focal heating of the tumor area. The concept presented above was extended to image-guided drug delivery so a contrast agent is encapsulated in the liposome as well. By encapsulating both the drug doxorubicin and a gadolinium-based magnetic resonance (MR) agent it is possible to quantify the temperature-induced drug delivery. Upon contrast agent release from the liposome, a contrast change on the MR images is created which will enable the quantification of released drug in the tumor. However, the use of paramagnetic liposomes employing gadolinium (Gd)-based MRI contrast agent might lead to Gd-induced toxicity since the liposomes are preferentially cleared by the liver and spleen, which leads to a high Gd3+ concentration in these organs. From patients suffering from severe renal impairment, it is known that prolonged retention of Gd-based contrast agent may lead to nephrogenic systemic fibrosis (NSF). As the liposomal encapsulation of [Gd(HPDO3A)(H2O)] will lead to preferential liver and spleen clearance, as opposed to renal clearance for the free contrast agent, the contrast agent will have a longer retention time in the body, raising questions about the safety of the concept. There was a need of finding an alternative for [Gd(HPDO3A)(H2O)], (ProHance®), a clinically approved contrast agent, so in a previous in-house study [Gd(HPDO3A) (H2O)] was replaced by Fe3+-deferoxamine (Fe3+-DFO) since iron has an established metabolic pathway. Unfortunately, a gradual release of Fe3+-DFO from the liposomes was observed upon heating, instead of a rapid and complete release at the melting phase transition temperature (Tm). The aim of this research was to improve the liposomal release of the CA as well as the stability of the liposomal formulation. Both improvements in release and stability were achieved by adapting the Fe3+-DFO complex used previously, to deferoxamine-N-succimidyl Fe(III), DFO-N-Suc-Fe (III), which allowed a higher intraliposomal pH, thereby minimizing the risk of hydrolysis. The association of Fe-DFO with doxorubicin was avoided by opting for a co-injection instead of co-encapsulation. This contrast agent can be used to monitor drug release from doxorubicin-loaded temperature-sensitive liposomes (TSLs). The end application would be the drug-dose painting for TSLs containing chemotherapy delivered by MR-guided HIFU (High Intensity Focused Ultrasound).
Descrição: Tese de mestrado integrado em Engenharia Biomédica e Biofísica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015
URI: http://hdl.handle.net/10451/20379
Designação: Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica e Biofísica
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