Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/20551
Título: Crosstalk between immunosuppressive myeloid and effector lymphoid cells in the tumour microenvironment
Autor: Santos, Sofia Mensurado
Orientador: Santos, Bruno Silva, 1973-
Telhada, Maria Margarida Blasques, 1951-
Palavras-chave: Linfócitos Tγδ
MDSC
Interleucina-17
Oncoimunologia
Teses de mestrado - 2015
Data de Defesa: 2015
Resumo: O sistema imunitário é constituído por estruturas organizadas e moléculas com papéis específicos na defesa contra patogénios e células transformadas, e é habitualmente segregado em dois principais componentes: o sistema inato e o adaptativo. O sistema inato está presente em todos os organismos multicelulares e é caracterizado por apresentar uma resposta rápida a padrões conservados em patogénios. O sistema adaptativo é caracterizado pela capacidade de gerar uma grande variedade de receptores de antigénios e células de memória que respondem de forma mais eficaz numa exposição repetida a um dado patogénio. O sistema inato é composto por células fagocíticas (neutrófilos, monócitos e macrófagos), células ‘’natural killer’’ (NK) e células que produzem mediadores inflamatórios como os basófilos, mastócitos e eosinófilos. O sistema adaptativo é composto por células T e B específicas para antigénios, cujos receptores são produzidos por recombinação somática. As células B, que se desenvolvem na medula óssea, após estimulação, secretam imunoglobulinas que são responsáveis pela eliminação de microorganismos extracelulares. As células T, que se desenvolvem no timo, apresentam funções auxiliadoras e citotóxicas, através da produção de citocinas e enzimas citolíticas. Os linfócitos T podem ser categorizados de acordo com as cadeias que expressam nos receptores de células T (TCR), em células Tαβ e células Tγδ. As células Tαβ ‘’naïve’’ são activadas em orgãos secundários linfóides por células apresentadoras de antigénios que processam e apresentam os antigénios conjugados com moléculas do complexo major de histocompatibilidade (MHC - major histocompatibility complex) à sua superfície. Em oposição, as células Tγδ populam os tecidos epiteliais e respondem rapidamente a sinais de stress. As células Tγδsão linfócitos que expressam TCRs compostos por uma cadeia γ e uma cadeia δ e que realizam recombinação somática para os originar. São, no entanto, consideradas células “innate-like” devido à sua capacidade de actuar como primeira linha de defesa, iniciar uma resposta inflamatória rápida e por se localizarem preferencialmente em tecidos epiteliais. São células que se caracterizam funcionalmente pela capacidade de rápida produção de interferão-gama (IFN-γ) e interleucina-17 (IL-17), em resposta a estímulos externos. Estas células são consideradas como não redundantes relativamente às células Tαβ essencialmente por apresentarem uma cinética de resposta diferente, reconhecerem antigénios distintos e apresentarem uma distribuição anatómica também ela distinta. Dependendo das suas funções efectoras, as células Tγδ podem ser categorizadas em duas populações: as produtoras de IFN-γ, que expressam o marcador de superfície CD27, e as produtoras de IL-17, que não expressam este marcador. As células Tγδ apresentam potentes propriedades antitumorais mediadas pela produção de granzimas, perforinas, FasL, TRAIL e IFN-γ, o que já foi demonstrado ter um papel importante na imunovigilância de células cancerígenas, tanto em ratinhos como em humanos. Nomeadamente, num modelo subcutâneo de melanoma (B16), estabelecido no laboratório de acolhimento, ratinhos deficientes para estas células (TCRδ-/-) apresentaram um maior desenvolvimento tumoral. Já em ratinhos da estirpe selvagem, as células Tγδ acumulam-se no tumor, onde apresentam funções citotóxicas potentes e produzem IFN-γ No sentido oposto, as células Tγδ foram recentemente associadas à promoção do desenvolvimento tumoral, em modelos de cancro do fígado e de ovário, devido à produção de IL-17. No entanto, o papel desta citocina no ambiente tumoral é muito controverso e continua a ser alvo de estudo. Neste trabalho utilizou-se uma linha celular de melanoma (B16), injectada intraperitonealmente, com o objectivo de estudar a resposta das células Tγδ durante o desenvolvimento tumoral. Observou-se que neste modelo as células Tγδ , ao contrário de outras células imunitárias como células T CD4, T CD8 e NK, não se acumulam em resposta ao estímulo da injecção tumoral. A análise funcional das células Tγδ revelou ainda que estas não são capazes de aumentar a expressão das citocinas IL-17 e IFN-γ nem de enzimas citolíticas, como granzima B e perforina. Desta análise conclui-se que as células Tγδ no ambiente tumoral deste modelo se encontram anérgicas. Em concordância com estes resultados, a análise do crescimento tumoral em ratinhos TCRδ-/- revelou que estes apresentam uma cinética semelhante aos ratinhos da estirpe selvagem. Estes resultados estabelecem que as células Tγδ apresentam um papel neutro no crescimento tumoral, não sendo responsáveis nem pela promoção nem pela eliminação da linha de melanoma B16 quando esta é injectada na cavidade peritoneal. Na tentativa de perceber se a “anergia” das células Tγδ se deve a um mecanismo de imunossupressão analisou-se a presença de células supressoras no ambiente tumoral. Nessa análise, verificou-se que a frequência de células T reguladoras, caracterizadas pela expressão dos marcadores de superfície CD4 e CD25, pelo factor de transcrição FoxP3 e pelas suas potentes capacidades de supressão de células T, está diminuida. Por esse motivo, estas são improváveis mediadores da supressão das células Tγδ. Pelo contrário, detectámos uma frequência aumentada de células supressoras de origem mielóide (MDSC, myeloid derived suppressor cells). As MDSC são uma população heterogénea de progenitores mielóides e células mielóides imaturas que são induzidas em situações patológicas, incluindo no desenvolvimento tumoral. Estas células são caracterizadas pela co-expressão dos marcadores de superfície CD11b e Gr-1. Em ratinho, as MDSC podem ser divididas em duas principais subpopulações, as células monocíticas supressoras de origem mielóide (Mo-MDSC, monocytic myeloid–derived suppressor cells) e as células polimorfonucleares supressoras de origem mielóide (PMN-MDSC, polymorphonuclear myeloid-derived suppressor cells). As Mo-MDSCs apresentam o fenótipo CD11b+Gr-1intLy6G-Ly6C+ enquanto as PMN-MDSC são caracterizadas por serem CD11b+Gr-1highLy6G+Ly6Cint. As MDSC têm a capacidade de suprimir as respostas de linfócitos T, tanto in vitro como in vivo, através de vários mecanismos conhecidos, como a produção de óxido nítrico e a diminuição da arginina disponível no meio. Sabe-se que as MDSC suprimem as células T CD8 citotóxicas e induzem o desenvolvimento de células T reguladoras, contribuindo para um desequilíbrio da resposta imunitária, no sentido de promover a tolerância e assim contribuindo para o desenvolvimento tumoral. No entanto, pouco se sabe sobre a interação entre as MDSC e as células Tγδ No nosso modelo (melanoma B16 intraperitoneal), observou-se um aumento tanto da subpopulação monocítica como da polimorfonuclear de MDSC, em relação a ratinhos sem tumor. Para perceber se as MDSC poderiam ter impacto na resposta das células Tγδ, recorremos ao anticorpo monoclonal anti-Gr-1 para as depletar. A injecção deste anticorpo em ratinhos com tumor levou à depleção específica de PMN-MDSC, visto que estas expressam níveis mais elevados do marcador de superfície Gr-1, relativamente às Mo-MDSCs. Esta depleção resultou na acumulação selectiva de células Tγδ no ambiente tumoral, sem alteração da frequência de células T CD4, T CD8 e NK. As células Tγδ que se acumularam em consequência da depleção das PMN-MDSC expressam a cadeia Vγ6 do receptor de células T e não expressam o marcador de superfície CD27. Em concordância com a falta de expressão desse marcador, estas células são produtoras de IL-17. Visto a IL-17 ter um papel controverso no contexto tumoral, avaliou-se qual o papel desta citocina e das células Tγδ no desenvolvimento tumoral, após depleção das PMN-MDSC. Observou-se que tanto os ratinhos IL-17-/- como os ratinhos TCRδ-/- apresentam um crescimento tumoral diminuido em relação aos ratinhos da estirpe selvagem. Esta observação implica que tanto as células Tγδ como a citocina IL-17 desempenham um papel pro-tumoral neste modelo. Os resultados apresentados nesta tese mostram, pela primeira vez, que as células Tγδ podem ser alvo de inibição pelas PMN-MDSC e que, contrariamente ao seu conhecido papel pro-tumoral, esta população mielóide pode mediar a protecção do hospedeiro, no contexto tumoral.
The tumour microenvironment contains a variety of immune cells that can either inhibit or promote tumour growth. These immune populations comprise γδ T cells, which have been described to provide large amounts of anti-tumour molecules, such as interferon-γ (IFN-γ) and cytolytic enzymes, but can also produce interleukin-17 (IL-17) that supports tumour growth. By contrast, in this thesis we report that, in a peritoneal melanoma B16 tumour model, γδ T cells are unresponsive and thus neutral to tumour growth. Upon tumour challenge, γδ T cells were unable to accumulate and to upregulate IL-17, IFN-γ, granzyme B and perforin expression, in comparison to steady-state. Consistent with this, TCRδ-/- mice displayed similar tumour growth kinetics to wild-type (WT) controls, further corroborating the inability of γδ T cells to respond to tumour challenge. Concomitantly, we observed an accumulation of myeloid-derived suppressor cells (MDSC), both of monocytic (Mo-MDSC) and polymorphonuclear (PMN-MDSC) origin, which are known to suppress tumour immunity. Hence, we hypothesized that MDSCs could prevent γδ T cell response in this model. To modulate MDSC we employed an anti-Gr-1 monoclonal antibody (mAb), which led to specific depletion of PMN-MDSC. Such manipulation resulted in γδ T cell-specific accumulation and increased proportion of IL-17-producing γδ T cells. These γδ T cells were characterized by the expression of a Vγ6+ T cell receptor, and by lack of CD27 expression. Analysis of TCRδ-/- and IL17-/- mice upon PMN-MDSC depletion revealed, by comparison with WT controls that both γδ T cells and IL-17 contributed to tumour growth. Collectively, the work presented in this thesis showed, for the first time, that γδ T cells can be targeted by PMN-MDSCs and that, contrary to their well-established pro-tumour role, this myeloid subset can also mediate host protection in the tumour context.
Descrição: Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015
URI: http://hdl.handle.net/10451/20551
Designação: Mestrado em Bioquímica
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