Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/20616
Título: Design and synthesis of small molecule modulators of p53
Autor: Ribeiro, Carlos Jorge Azevedo Costa, 1980-
Orientador: Santos, Maria Manuel Duque Vieira Marques dos
Moreira, Rui, 1960-
Rodrigues, Cecília M. P., 1968-
Palavras-chave: Teses de doutoramento - 2015
Data de Defesa: 2015
Resumo: Among the tumor suppressor genes, p53 is one of the most studied. It is widely regarded as the “guardian of the genome”, playing a pivotal part in the preservation of genomic integrity by regulating cell cycle, apoptosis, DNA repair, senescence and angiogenesis, and consequently has a major role in carcinogenesis. The function played by p53 in tumor suppression is further highlighted by the fact that direct inactivation of this gene occurs in more than 50% of malignancies. In addition, in tumors that retain wild type p53 status, its function is usually inactivated by overexpression of negative regulators, primarily murine double minute-2 (MDM2), mainly through MDM2 gene amplification or by activity loss of MDM2 inhibitor ARF. Hence, restoring p53 function in cancer cells represents a valuable anticancer approach. Several strategies are being developed, and in particular targeting p53-MDM2 interaction has emerged as a promising viable approach when dealing with cancers that retain wild type p53 function. These two proteins regulate each other through an autoregulatory feedback loop: activation of p53 stimulates the transcription of MDM2, which in turn binds to the Nterminal transactivation domain of p53, disabling its transcriptional function. p53- MDM2 interaction inhibitors share common structural features: a rigid heterocyclic scaffold with three lipophilic groups that mimic the three pivotal p53 Phe19, Trp23 and Leu26 that interact with MDM2. Seven compounds have already entered clinical trials. The main goal of this PhD thesis was to develop new anticancer agents containing a spirooxindole scaffold with different spiro five-membered rings: isoxazoline, oxadiazoline, and triazolines. The spirocycle can potentially function as the rigid heterocyclic scaffold, from which three lipophilic groups are projected to mimic the three pivotal p53 amino acids. This work followed three major strategies: synthesis of spirooxindole derivatives by 1,3 dipolar cycloaddition; biological evaluation of the compounds synthesized; and stability assessment. Overall this PhD thesis contributed with three new families of spirooxindoles with in vitro anti-cancer activity. The most active derivative possessed a GI50 of 1.72 μM in HCT116 p53(+/+) cell line. Furthermore their ability to disrupt the interaction between p53 and MDM2 was confirmed by implementing a cell-base in vitro bimolecular fluorescence complementation assay (BiFC) and the apoptotic outcome verified by immunoblotting analysis and luminescent caspase 3/7 activity assay.
A proteína p53 foi descoberta há mais de 35 anos e é actualmente um dos mais estudados supressores tumorais, sendo designada até por “guardião do genoma”. A p53 desempenha um papel crucial na célula: regulação do ciclo celular, apoptose, reparação do DNA, senescência e angiogénese e, consequentemente, tem um papel decisivo na carcinogénese. Este papel central da p53 como supressor tumoral é incontestável, como observado no aumento da predisposição para o desenvolvimento de tumores em indivíduos com a síndrome Li-Fraumeni, caracterizados por serem detentores de uma mutação no gene da p53 (TP53) e em ratos sem o gene que codifica esta proteína (Trpnull). Actualmente acredita-se que em virtualmente todos os cancros se verifica algum tipo de perda da função supressora tumoral da p53. Em cerca de 50 % dos tumores, esta perda é directa, isto é, é devido à presença de uma mutação no gene Tp53 ou ocorre indirectamente, por inactivação das vias de sinalização celular da p53. Em tumores que retêm o fenótipo selvagem da p53, normalmente ocorre aumento da expressão de reguladores negativos da p53, como por exemplo a MDM2 e MDM4. Em condições normais, os níveis de expressão da p53 são mantidos em valores baixos. Contudo em resposta a sinais de stress, como por exemplo a danos genotóxicos, a p53 é estabilizada e activada por meio de modificações pós-tradução. Como esta proteína é um factor de transcrição, a sua activação levará a um aumento da expressão de determinados genes-alvo que culminará numa resposta apropriada, incluindo prevenção da tumorigénese. Em contraste a inactivação da função celular da p53 pode levar à proliferação de células danificadas, podendo resultar no aparecimento e desenvolvimento de tumores. Devido à importância da inactivação da via da p53 para o desenvolvimento tumoral, conceber estratégias que visam a reactivação desta proteína é de grande interesse, especialmente se permitirem um efeito apoptótico selectivo em células cancerígenas. Estas estratégias podem ser agrupadas em duas categorias: direccionadas para cancros detentores de uma versão mutada da p53 ou para cancros que conservam a sua forma nativa. No primeiro grupo, o objectivo será focado em estratégias que permitam o correcto enrolamento da p53 mutada com o intuito de restaurar a sua função. No segundo grupo, o objectivo é inibir a função de reguladores negativos da p53. A segunda categoria compreende diversas estratégias, incluindo: inibidores das sirtuínas, inibidores da S100B, inibidores da actividade E2 ligase da MDM2, inibidores da proteína MDM4, compostos que promovem a disrupção do nucléolo, agentes intercalantes e inibidores da exportação nuclear de proteínas. Contudo, a estratégia que tem suscitado mais interesse nos últimos 10 anos corresponde à inibição da interacção entre a p53 e a MDM2. Estas duas proteínas auto-regulam-se: a activação da p53 estimula a transcrição da MDM2 e esta proteína, por sua vez, liga-se ao terminal N da p53 desactivando a sua função transcricional. A proteína MDM2 também promove a exportação da p53 do núcleo e favorece a sua degradação mediada pelo proteasoma, através da função de E3 ubiquitina ligase. Estes eventos conduzem a uma diminuição dos níveis de p53 que, por sua vez, promovem uma diminuição da expressão da MDM2, permitindo assim que a proteína p53 possa ser novamente activada. A estrutura cristalográfica da p53 ligada à MDM2 revelou que esta interacção ocorre numa pequena fenda hidrofóbica superficial na proteína MDM2. Os resíduos mais importantes da p53 que contribuem para esta interacção são a Phe19, o Trp23 e a Leu26. Portanto, quando se desenham inibidores da interacção p53-MDM2 é necessário que estes sejam capazes de mimetizar os três aminoácidos da p53 supracitados. Diversas famílias de compostos já foram descritas na literatura capazes de inibir esta interacção, sendo as mais importantes: cis-imidazolinas, spiropirrolidina oxindoles, pirrolina-2-carboxamidas, piperidinonas, benzodiazepinedionas e isoindolinonas. Sete compostos inibidores da interacção p53-MDM2 encontram-se em ensaios clínicos. Compostos com um núcleo spirooxindole são encontrados em produtos naturais e apresentam diversas actividades biológicas. Em particular, já se encontram descritos na literatura compostos spiropirrolidina oxindoles com diversas actividades cancerígenas, como por exemplo inibidores da polimerização dos microtúbulos e, consequente, paragem da mitose e inibidores da interacção p53-MDM2. Deste segundo grupo, o composto MI-77301 encontra-se em ensaios clínicos. O objectivo principal desta tese de doutoramento consistiu em desenvolver novos agentes anticancerígenos detentores de um esqueleto spirooxindole fundido com diferentes anéis de cinco membros: isoxazoline, oxadiazolina e triazolina. Diferentes grupos essencialmente hidrofóbicos foram introduzidos no esqueleto central, numa tentativa de encontrar aqueles que melhor mimetizam os três aminoácidos da p53. Para cada uma destas famílias foram descritos os métodos sintéticos envolvidos e a respectiva avaliação biológica in vitro dos derivados sintetizados. Os compostos foram sintetizados por cicloadição 1,3-dipolar entre 3-imino ou 3-metileno indolina-2-onas e dipolos 1,3 gerados in situ por desidrohalogenação de cloretos de hidroximoílo e cloretos de hidrazonoílo. Para o primeiro núcleo sintetizado – spiroisoxazoline oxindoles – são ainda descritas tentativas de síntese enanteosselectiva do composto mais activo. Esta parte do trabalho foi realizada num período de três meses no grupo da Dr.Annaliese K. Franz na Universidade da Califórnia – Davis (EUA). Em paralelo, neste período na Califórnia, foi também desenvolvida uma metodologia de síntese enanteosselectiva de um derivado spiropirrolina oxindole. Os estudos in vitro permitiram avaliar e demonstrar a potencialidade dos compostos como agentes anticancerígenos, através da realização de ensaios antiproliferativos em diversas linhas celulares cancerígenas: par isogénico HCT116 p53(+/+) e p53(-/-) de cancro colorrectal humano, carcinoma hepatocelular humano HepG2, adenocarcinoma colorrectal humano SW620, cancros da mama MCF-7 e MDA-MB- 231 e uma linha celular epitelial embrionária humana de rim. A capacidade dos compostos interferirem com a interacção entre a p53 e a MDM2 foi também avaliada e confirmada in vitro através da implementação de um método de fluorescência de complementação biomolecular (BiFC) realizado em células. A capacidade dos compostos induzirem a apoptose foi avaliada por ensaios de Western blotting e luminescência, onde se verificou um aumento da actividade das caspases e um aumento da clivagem do seu substrato PARP. Por último, foram efectuados ensaios de estabilidade química em tampão fosfato pH 7.4, em plasma e em microssomas de rato, para dois compostos de cada família. Estes ensaios servirão para ajudar na escolha dos compostos a seguir para ensaios in vivo numa futura continuação do trabalho. Foram sintetizados trinta e três compostos da primeira família (spiroisoxazoline oxindoles). O derivado mais activo possui um GI50 de 26.50 μM em HCT116 p53(+/+). Com a segunda família de compostos (spirooxadiazoline oxindoles) conseguiu-se aumentar a actividade para 1.72 μM, na mesma linha celular. Nesta série de compostos foram sintetizados trinta e dois derivados, dos quais nove revelaram possuir um GI50 inferior a 10 μM. Na terceira família sintetizada (spirotriazolina oxindoles) foi possível encontrar cinco derivados com GI50 abaixo dos 10 μM na linha celular MCF-7 (p53 fenótipo selvagem). Curiosamente outros cinco derivados revelaram ser selectivos para a linha celular tumoral MDA-MD-231 (p53 mutada). Desta série foram sintetizados vinte e sete derivados. Estudos preliminares de docking molecular corroboraram a possibilidade destes compostos conseguirem mimetizar os três resíduos da p53.
Descrição: Tese de doutoramento, Farmácia (Química Farmacêutica e Terapêutica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2015
URI: http://hdl.handle.net/10451/20616
Designação: Doutoramento em Farmácia
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