Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/20683
Título: Study of drug formulations and development of immunosensing interfaces with membrane model systems
Autor: Paiva, Telmo Manuel Oliveira
Orientador: Almeida, Rodrigo Freire Martins de
Semedo, Ana Pimenta da Gama da Silveira Viana,1972-
Palavras-chave: Sistemas modelo de biomembranas
m-cresol
Espectroscopia de fluorescência
Biofuncionalização de superfície de ouro
Construção e desenvolvimento de imunossensores
Teses de mestrado - 2015
Data de Defesa: 2015
Resumo: Grande parte dos processos bioquímicos encontra-se associada às membranas biológicas enquanto estruturas capazes de delimitar variados compartimentos e, simultaneamente, desempenhar funções ao nível da sinalização, comunicação e transmissão de informação, bem como de servir de suporte a inúmeras moléculas essenciais a esses processos bioquímicos. A capacidade de desempenhar todos estes papéis prende-se com o facto de as membranas biológicas apresentarem uma complexa estrutura, possuindo na sua composição, para além de inúmeras proteínas, um vasto leque de moléculas lipídicas, conferindo-lhes diversas propriedades físicas características. Por si só, os lípidos são caracterizados por uma elevada diversidade estrutural, quer ao nível da região hidrófila, quer ao nível das cadeias alifáticas, que podem diferir no seu comprimento, no grau de insaturação hidroxilação, etc. Assim, no sentido de perceber toda esta complexidade, diferentes sistemas modelo capazes de mimetizar as membranas biológicas têm surgido, tendo como ponto de partida a estrutura da bicamada lipídica proposta por Gorter e Grendel, em 1925. Estes modelos, cujo tamanho, geometria e composição podem ser adaptados face aos objectivos, têm sido amplamente utilizados no estudo de processos tão variados como o comportamento de diferentes fases lipídicas ou mesmo a fusão de membranas. Os sistemas modelo de biomembranas vão desde sistemas de bicamadas lipídicas em suspensão (lipossomas) com diferentes tamanhos e diferente número de bicamadas, a bicamadas lipídicas suportadas (SLBs). Nos estudos com sistemas modelo, uma vasta gama de técnicas de caracterização biofísicas pode ser aplicada, incluindo diferentes espectroscopias, como a espectroscopia de fluorescência e a espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), e diferentes técnicas de caraterização de superfície, tais como a microscopia de força atómica (AFM), a elipsometria, ainda que pouco utilizada, e a ressonância do plasmão de superfície. A interacção de pequenas moléculas com interesse biológico com biomembranas tem sido um tópico amplamente estudado recorrendo aos sistemas modelo. Os sistemas compostos por monocamadas lipídicas suportadas foram ainda utilizados, neste trabalho, na criação e desenvolvimento de imunossensores, os quais podem ser utilizados como importantes ferramentas de diagnóstico de diversas patologias. Na primeira parte deste trabalho, que se encontra escrita sob a forma de um artigo para publicação, estudou-se a interacção de um derivado fenólico, o m-cresol (3- metilfenol), com a membrana biológica segundo diferentes perspectivas. Para tal, recorrendo a dois tipos de sistemas modelo membranares, os lipossomas e as SLBs, foram empregues duas técnicas de caracterização, a espectroscopia de fluorescência e a AFM. O m-cresol é um excipiente frequentemente utilizado em elevadas concentrações em diversas formulações farmacêuticas e, recentemente, tem sido associado a diversos casos de toxicidade após utilização de formulações prescritas para o tratamento da diabetes. No entanto, os efeitos da sua interacção com membranas biológicas encontram-se ainda por decifrar. Utilizando lipossomas constituídos por misturas ternárias de 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) / N-palmitoil-esfingomielina (PSM) / Colesterol (Chol), nas proporções adequadas para abranger a linha de conjugação que contém a proporção equimolar 1:1:1 do diagrama de fases publicado para esta mistura, em presença de fase líquido desordenado (ld), líquido ordenado (lo) e coexistência de ambas. O POPC é um dos glicerofosfolípidos mais abundante nas membranas celulares de organismos eucariotas, a PSM o principal esfingofosfolípido em membranas celulares de mamíferos e o Chol o esterol que se encontra em níveis mais elevados nas mesmas. Esta mistura foi escolhida por representar um modelo bem estabelecido que mimetiza a formação de jangadas lipídicas. Através de medidas de anisotropia de fluorescência em estado estacionário, de decaimentos de fluorescência e de medidas de transferência de energia por ressonância de Förster (FRET), utilizou-se a fluorescência intrínseca do m-cresol para inferir acerca do seu comportamento na presença de lipossomas (vesículas unilamelares grandes (LUVs)). Para além disso, recorreu-se a sondas de fluorescência de membrana para melhor caracterizar esta interacção: N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)-1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, sal trietilamónio (NBD-DPPE) e N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)-1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (NBD-DOPE), que têm preferência pelas fases lo e ld, respectivamente; 4-(2-(6-(dibutilamino)-2-naftalenil)etenil)-1-(3-sulfopropil)-piridínio (di-4-ANEPPS), que permite extrair informação acerca do estado de hidratação da bicamada; ácido trans-parinárico (t-PnA), que traduz o grau de empacotamento das cadeias acilo dos fosfolípidos e N-(lissamina rodamina B sulfonil)-1,2-dioleoil-sn-3-fosfatidiletanolamina (Rhod-DOPE), que, foi usado em medidas de FRET como aceitador com NBD-DPPE enquanto dador, permitem concluir acerca de alterações do tamanho das jangadas lipídicas. Paralelamente, utilizando SLBs depositadas em mica, compostas por misturas ternárias de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC)/PSM/Chol na proporção 2:2:1, um sistema que apresenta coexistência de fases ld e lo e mimetiza jangadas lipídicas, foram efectuados estudos de AFM para avaliar em tempo real os efeitos causados pelo m-cresol nas jangadas lipídicas. Os resultados obtidos permitiram concluir que os efeitos do m-cresol sobre as bicamadas lipídicas deverão inicialmente estar restritos à sua superfície, sem perturbação das cadeias acilo dos fosfolípidos. Esta interacção superficial deverá fazer-se notar principalmente ao nível das zonas de interface entre as fases ld e lo, levando ao desaparecimento das jangadas lipídicas com o tempo e com o aumento da concentração de m-cresol. Globalmente, observou-se que o m-cresol apresenta preferência por fases lo, através da do alinhamento do seu momento dipolar com o dipolo da bicamada lipídica, levando ao desaparecimento das jangadas lipídicas. Como exemplo de uma formulação farmacêutica de insulina humana contendo elevadas concentrações de m-cresol, foi utilizada a Humulina®, uma das formulações mais utilizadas no tratamento da diabetes. Foram efectuados os mesmos estudos na presença desta formulação e os efeitos observados são semelhantes aos que se observaram na presença de m-cresol, ainda que de uma forma menos acentuada. Isto poderá indicar que, quando inserido em formulações, o m-cresol apresenta efeitos adversos, ainda que uma parte deles possa ser atenuada pela interacção com os outros componentes da formulação. A segunda parte deste trabalho, realizada no âmbito da Sétima Cooperação Científica e Tecnológica Sino-Portuguesa (2013-2015) sob o tema “Construction of Novel Sensitive Biosensing Interfaces for Tumor Markers” foi parcialmente realizada no “Institute of Mechanics, Chinese Academy of Sciences, Beijing”. Recorrendo a modelos membranares depositados em substratos de ouro, teve como objectivo a construção de interfaces para imunossensores estáveis, biomiméticos e que reduzam a adsorção não-específica de proteínas, recorrendo a uma técnica avançada, pouco recorrente e com elevada capacidade de detecção, a elipsometria de imagem de reflexão interna total (TIRIE). Como ponto de partida, foi utilizada uma abordagem já testada com ditiocarbamatos (DTCs) imobilizados em superfícies de ouro para o biorreconhecimento específico de anticorpos e antigénios. Este método é particularmente útil, na medida em que permite a modificação da superfície do ouro e a imobilização de ligandos, nomeadamente a proteína A (que permite uma orientação correcta do anticorpo que a ela se liga posteriormente) em apenas um passo e, para além disso, não é necessário recorrer à activação dos grupos dos grupos funcionais para a imobilização covalente do anticorpo. Para além de IgG e Anti-IgG, esta plataforma foi testada com o antigénio específico da próstata (PSA) e anti-PSA por TIRIE. Esta técnica foi utilizada para a deteccção e monitorização em tempo real do reconhecimento do anticorpo e respectivo antigénio pelo immunosensor imobilizado no substrato de ouro. Globalmente foi possível mostrar que os DTCs imobilizados em ouro podem ser utilizados no reconhecimento de PSA e Anti-PSA e, portanto, devem ser encarados enquanto possíveis interfaces para a detecção específica de marcadores tumorais. Ainda no sentido do desenvolvimento de imunossensores, foi testada e optimizada uma nova abordagem recorrendo à deposição de fosfolípidos sobre uma monocamada auto-montada (SAM) depositada num substrato de ouro. Para a formação da SAM utilizou-se 11-amino-1-undecanetiol, que se liga fortemente à superfície do ouro por meio de um grupo tiol. Após activação do grupo carboxilo estrategicamente localizado na extremidade da cadeia acilo do 1-miristoil-2-(14-carboximiristoil)-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC-COOH), este foi depositado sobre a SAM, ligando-se covalentemente ao seu grupo amina, localizado na sua extremidade. Entre as moléculas de DMPC-COOH foram posteriormente inseridas moléculas de ácido 2-hidroxioleico que, contendo também um grupo carboxílico numa extremidade, pode ser activado para imobilizar proteínas covalentementemente. Entre cada um dos passos da construção do imunossensor acima descritos foi utilizada elipsometria convencional para estimar a espessura da superfície, confirmando assim a correcta execução de cada passo de modificação. Com o mesmo objectivo foram também efectuadas experiências de AFM como forma de visualização da topografia da superfície durante a construção do imunossensor. Tal como anteriormente, a técnica de TIRIE foi utilizada para monitorizar o reconhecimento específico dos anticorpos e respectivos antigénios (IgG e Anti-IgG) e, como complemento, foi também utilizada a técnica de SPR. Com este estudo mostrou-se que esta plataforma apresenta algum potencial enquanto imunossensor capaz de evitar interacções não específicas, um dos requisitos necessários para a construção de um biossensor. Para além disto, foi demonstrada a possibilidade da utilização de fosfolípidos modificados para a construção de monocamadas estáveis, que podem ser aplicadas como componentes de biossensores. Com o trabalho apresentado ao longo desta dissertação mostra-se, uma vez mais, a importância da utilização de sistemas modelo na mimetização das membranas biológicas e enquanto versáteis ferramentas, quer para o estudo de fenómenos associados ao comportamento das biomembranas no seu contexto natural, quer para o desenvolvimento de importantes plataformas usadas na detecção de patologias.
Different model membrane systems have been developed and improved over the years, in order to study the complexity associated with the structure and function of biological membranes. These models retain the lipid bilayer structure, and their size, geometry and composition can be tailored regarding the goals of each specific study. They include free-standing lipid bilayers (liposomes), whit several sizes and layers, and supported lipid bilayers (SLBs). The studies employing membrane model systems can be performed with a wide range of biophysical characterization techniques, such as spectroscopies, namely fluorescence spectroscopy, surface characterization techniques, like atomic force microscopy (AFM) and ellipsometry. In this work, biomembrane model systems were applied regarding two different perspectives. Firstly, m-cresol interaction with biological membranes was studied in liposomes (large unilamellar vescicles (LUVs)) with several fluorescence spectroscopy techniques and SLBs with AFM. m-cresol is an excipient widely used in pharmaceutical formulations, like Humulin, a formulation prescribed to diabetes treatment. Recently, several studies have reporting cases of toxicity associated with m-cresol usage but, despite that, its effects on biomembranes are not described. The steady state fluorescence anisotropy and fluorescence lifetime results, both of m-cresol intrinsic fluorescence and membrane fluorescent probes, in combination with real-time AFM experiments, show that m-cresol interacts with lipid bilayers superficially, leading to the bilayer components reorganization. Furthermore, it keeps this ability when integrated in Humulin, but with less intensity. The purpose of the second part of the work was the building of biosensing interfaces to avoid protein non-specific adsorption using different gold modifications. The previously reported dithiocarbamate (DTC) formation principle on gold substrates was used to test prostate specific antigen (PSA) and anti-PSA, showing that this immunosensor platform can be employed in tumor markers detection. One more complex approach, based on utilization of self-assembled monolayers (SAMs) and modified lipids, was also tested. The covalent immobilization of IgG and Anti-IgG was successfully achieved with this immunosensor interface that may be used to avoid non-specific adsorption. The immunosensors construction was followed by conventional ellipsometry and AFM and its performance was monitored using surface plasmon resonance (SPR) and total internal reflection imaging ellipsometry (TIRIE).
Descrição: Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015
URI: http://hdl.handle.net/10451/20683
Designação: Mestrado em Bioquímica
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