Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/20805
Título: Management of skin cancer by agonists of 5-HT1A and antagonists of 5-HT2A receptors
Autor: Menezes, Ana Catarina da Silva Fernandes Saraiva de
Orientador: Ascenso, Andreia
Oliveira, Helena
Palavras-chave: Cancro da pele
Recetores 5-HT1/2A
1-NPZ
Apoptose
Administração tópica
Teses de mestrado - 2015
Data de Defesa: 2015
Resumo: A pele é o maior órgão humano e apresenta funções importantes quer a nível neuroendócrino, quer imunológico. A presença de um análogo do eixo hipotalâmico-hipofisário-adrenal na pele permite reagir a fatores externos de stress e modular as funções da mesma, tais como a melanogénese. A serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT) é um neuromodelador importante que atua como fator de crescimento no cancro da pele, uma vez que os seus recetores na pele poderão estar envolvidos na imunossupressão induzida pela radiação UV, danos no ADN, stress oxidativo e proliferação celular. O 1-(1-Naftil)piperazina (1-NPZ), agonista do recetor 5-HT1A e antagonista do recetor 5-HT2A, tem vindo a revelar efeitos promissores ao inibir a imunossupressão induzida pela radiação UV e, consequentemente, a fotocarcinogénese. Para tal, a presença do fotorecetor ácido trans-urocânico (ácido 3-(1H-imidazol-4-li)-2-propenóico, AUC) na epiderme é fundamental. Com a exposição aos raios UV, o trans-AUC isomeriza na sua configuração cis e esta, por sua vez, leva à imunossupressão. Contudo, o mecanismo de ação do cis-AUC ainda não foi devidamente elucidado. Desta forma, nós tentámos investigar se o 1-NPZ seria igualmente capaz de tratar a forma maligna e mais letal do cancro da pele. O melanoma tem origem nos melanócitos da epiderme que, por sua vez, são os principais produtores de serotonina ao nível da pele e possuem ambos os recetores 5-HT1/2A. O melanoma é ainda uma das doenças mais desafiantes, o que enfatiza a importância do nosso trabalho ao nível da comunidade científica. A administração tópica de fármacos anticancerígenos representa uma abordagem terapêutica promissora para o tratamento eficaz do cancro da pele. As vesículas ultradeformáveis (VUD) são nanosistemas recentes que permitem melhorar o transporte dérmico e/ou transdérmico de vários compostos. Os benefícios destes sistemas vão desde o aumento da absorção do fármaco através da pele com uma libertação continuada a uma menor degradação do fármaco encapsulado ou incorporado. Os transetossomas (TE) são um tipo de VUD que deriva de duas vesículas lipídicas distintas, transferssomas e etossomas, abrangendo as vantagens de ambas. Os TE apresentam assim novas propriedades de penetração mais eficaz das vesículas ao nível das camadas mais profundas da pele o que, por sua vez, se deve à presença de um tensioativo e de um álcool na sua composição. De facto, a presença sinérgica destes dois componentes contribui para a elevada deformabilidade dos TE, permitindo a sua fácil penetração através dos poros da pele mais pequenos do que o seu próprio tamanho. Os dmsossomas (DM), por outro lado, são um novo tipo de vesícula lipídica que contém dimetilsulfóxido (DMSO) na sua composição, tendo sido recentemente desenvolvidos pelo nosso grupo de investigação. O DMSO atua diretamente na pele enquanto promotor de penetração ao invés de aumentar a deformabilidade das vesículas. Deste modo, o mecanismo de ação do DMSO envolve a sua interação com os domínios lipídicos do estrato córneo, interferindo com essa mesma organização estrutural. Adicionalmente, o DMSO é considerado um “solvente universal” e possui ainda atividades biológicas relevantes. O objetivo deste estudo prendeu-se com a investigação do efeito terapêutico do 1-NPZ em células humanas de melanoma MNT-1 e com o subsequente desenvolvimento de formulações de transetossomas (NPZ-TE) e dmsossomas (NPZ-DM) com 1-NPZ enquanto novos nanotransportadores de administração tópica para o tratamento do cancro da pele. Assim sendo, este trabalho procurou explorar uma perspetiva importante e original da ação dos neurotransmissores ao nível da pele e pretendeu ainda ultrapassar alguns obstáculos dos tratamentos atuais para o cancro da pele, tais como: inacessibilidade do tumor, eficácia reduzida, efeitos secundários graves, elevados custos e disponibilidade limitada. Ambas as formulações tópicas desenvolvidas neste trabalho, NPZ-TE e NPZ-DM, deverão ser mais seguras e benéficas, com um grande potencial para gerar avanços no tratamento do cancro da pele. Uma melhor evolução clínica e maior qualidade de vida para as pessoas que padecem desta doença seria o mais desejável. O verdadeiro impacto deste trabalho, quer a nível científico, quer ao nível da sociedade, conta desde logo para o seu sucesso. Inicialmente, tanto as condições de exposição ao 1-NPZ como a viabilidade celular foram analisadas com recurso ao método do MTT. De seguida, avaliou-se a dinâmica do ciclo celular, produção de espécies reativas de oxigénio (ERO) e eventos apoptóticos por citometria de fluxo. A técnica da reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa em tempo real foi ainda utilizada com o intuito de quantificar os níveis de expressão de genes envolvidos no processo de imunossupressão e na progressão do cancro. O tratamento com 1-NPZ durante 24 h levou à redução da viabilidade celular, bem como à indução da apoptose nas células MNT-1 de uma forma dependente da concentração. Simultaneamente, o 1-NPZ conduziu a um atraso na fase S do ciclo celular e aumentou a produção de ERRO nestas células. Para além disso, a expressão da ciclooxigenase-2 (COX-2) aumentou significativamente após o tratamento com 1-NPZ. O conjunto destes resultados sugere que o 1-NPZ foi capaz de induzir stress oxidativo e a paragem do ciclo celular o que, por sua vez, levou à morte celular por apoptose das células de melanoma. Por outro lado, a caracterização físico-química dos NPZ-TE e NPZ-DM baseou-se na avaliação de vários parâmetros, incluindo o tamanho médio das vesículas e o potencial zeta por dispersão dinâmica e eletroforética da luz, respetivamente. Adicionalmente, a deformabilidade das vesículas foi avaliada pela filtração sob pressão e os estudos de reologia foram realizados por viscosimetria. A espetroscopia e a cromatografia líquida de alta eficiência foram ainda usadas para determinar ambos os rendimentos lipídico e de encapsulação do fármaco, respetivamente. Por último, os estudos de administração tópica in vitro foram realizados utilizando células de difusão de Franz e pele de leitão com o objetivo de avaliar os perfis de penetração e permeação das formulações vesiculares. Em ambos os sistemas, NPZ-TE e NPZ-DM, obtiveram-se resultados positivos ao nível do tamanho médio, potencial zeta, deformabilidade e reologia. O rendimento de encapsulação do 1-NPZ foi de 90,6% para os NPZ-TE e de 95,8% para os NPZ-DM, revelando que ambas as formulações são excelentes candidatos para fins terapêuticos. Os resultados in vitro também demonstraram uma penetração aumentada do 1-NPZ na pele de leitão, especialmente por NPZTE (0,31 μg/cm2). Em suma, este estudo demonstrou o potencial dos recetores da serotonina, nomeadamente os 5-HT1/2A, enquanto alvos terapêuticos para o tratamento do cancro da pele do tipo melanoma, identificando pela primeira vez o 1-NPZ como um agente quimioterapêutico promissor. Os resultados obtidos encorajam-nos a continuar os estudos com ambas as formulações para o tratamento tópico do melanoma.
The skin is the largest organ in the body with important neuroendocrine and immune functions. In fact, skin has its own hypothalamic–pituitary–adrenal axis, which in turn reacts to external stress factors and regulates skin functions, including melanogenesis. Serotonin (5-hydroxytryptamine, 5-HT) is an essential neuromodulator that can act as a growth factor for skin cancer, since its skin receptors may be involved in UV-induced immunosuppression, DNA damage, oxidative stress and cells proliferation. 1-(1-Naphthyl)piperazine (1-NPZ) is both an agonist of 5-HT1A and antagonist of 5-HT2A receptors that has shown promising effects by inhibiting UV-induced immunosuppression and, consequently, photocarcinogenesis. Therefore, we attempted to investigate whether 1-NPZ was also capable of treating the malignant and most deadly form of skin cancer. Melanoma arises from epidermal melanocytes, which are the main producers of serotonin in the skin and possess both 5-HT1/2A receptors. It is also one of the most challenging malignancies to address therapeutically, emphasizing the importance of our work in the scientific community. Topical administration of anticancer drugs represents a potential therapeutic approach for the effective treatment of skin cancer. Ultradeformable vesicles (UDV) are novel advantageous nanosystems capable of improving the dermal and/or transdermal delivery of several drugs. Transethosomes (TE) descend from both transfersomes and ethosomes, thereby having pioneering permeation-enhancing properties due to the existence of an edge activator and an alcohol in their composition. The synergistic presence of these two components contributes to the high deformability of TE, allowing their easy penetration across skin pores much smaller than the vesicles size. Dmsosomes (DM), on the other hand, are a new type of lipid vesicles containing dimethyl sulfoxide (DMSO), and were recently developed by our research group. DMSO acts directly on the skin as a penetration enhancer, rather than increasing vesicles deformability. Moreover, DMSO is regarded as a “universal solvent” and has important biological activities. The aim of the present study was to investigate the therapeutic effect of 1-NPZ on human MNT-1 melanoma cells, and posteriorly develop 1-NPZ-loaded transethosomes (NPZ-TE) and dmsosomes (NPZ-DM) as novel topical delivery nanocarriers for the treatment of skin cancer. Therefore, this work aimed to explore an important and original perspective of neurotransmitters action at skin level, and intended to overcome some drawbacks of the current treatments for skin cancer, such as tumor inaccessibility; poor effectiveness; strong side effects; high costs and limited availability. Both topical formulations developed in this work should be more secure and beneficial with a high potential to generate advances in skin cancer management. An improved clinical outcome and higher quality of life for people diagnosed with this malignancy would be desirable. The real impact of this work, from scientific to societal, counts to its success. Firstly, the exposure conditions of 1-NPZ as well as cell viability were evaluated by MTT assay. Cell-cycle dynamics, reactive oxygen species (ROS) production and apoptosis were all evaluated by flow cytometry. Reverse transcription RTPCR was also performed to quantify the expression levels of genes involved in immunosuppression events and cancer progression. Treatment with 1-NPZ for 24 h reduced cell viability and induced apoptosis on MNT-1 cells, in a dose-dependent manner. Simultaneously, 1-NPZ mediated Sphase delay in cell-cycle dynamics and increased ROS production. Moreover, the expression of cyclooxygenase-2 (COX-2) increased significantly following treatment with 1-NPZ. All these findings suggest that 1-NPZ was able to induce oxidative stress and a cell cycle delay, which in turn led to apoptotic cell death in melanoma cells. The physicochemical characterization of both NPZ-TE and NPZ-DM was based on the evaluation of several parameters, including the mean vesicles size and zeta potential by dynamic and electrophoretic light scattering, respectively. Vesicle deformability was assessed by pressure driven transport, whereas rheology studies were performed by viscometry. Spectrophotometry and high performance liquid chromatography were both used to determine lipid and drug entrapment yields, respectively. Finally, in vitro topical delivery studies were also achieved using Franz diffusion cells and newborn pig skin in order to evaluate the penetration and permeation profiles of the vesicle formulations. Either NPZ-TE or NPZ-DM showed positive results in terms of mean size, zeta potential, deformability and rheology. 1-NPZ entrapment yield was 90.6% for NPZ-TE and 95.8% for NPZ-DM, which indicated that both formulations are excellent candidates for therapeutic purposes. In vitro data also exhibited an improved penetration of 1-NPZ into newborn pig skin, especially by NPZ-TE (0.31 μg/cm2). In summary, this study revealed the potential of serotonin receptors, namely 5-HT1/2A, as therapeutic targets for the treatment of melanoma skin cancer, identifying for the first time 1-NPZ as a promising chemotherapeutic agent. Additionally, the positive results here obtained encourage us to carry on the studies on both formulations for the topical treatment of such malignancy.
Descrição: Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2015
URI: http://hdl.handle.net/10451/20805
Designação: Mestrado em Ciências Biofarmacêuticas
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