Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/20841
Título: Molecular mechanism of melanin transfer from donor melanocytes to recipient keratinocytes
Autor: Festas, Tiago André Carrilho
Orientador: Barral, Duarte
Zilhão, Rita, 1959-
Palavras-chave: Rab11b
Rab11-family interacting proteins (Rab11-FIPs)
Melanina
Pigmentação da pele
Tráfego vesicular/membranar
Teses de mestrado - 2015
Data de Defesa: 2015
Resumo: The skin is the largest organ of the human body. From ancient times, the color of skin has been an intriguing feature. Moreover, a large number of diseases are associated with skin disorders such as Griscelli syndrome, Hermansky-Pudlak syndrome and Waardenburg syndrome. Therefore, therapies directed to pigmentation disorders and also cosmetic applications have been intensively studied. Thus it is essential to understand the molecular mechanisms underlying of pigmentation disorders. The “epidermal-melanin unit” is the functional complex that confers color and photoprotective properties to the skin. This unit is composed by melanocytes and keratinocytes. Epidermal melanocytes are highly specialized cells that synthesize and store the pigment melanin in unique membrane-bound organelles termed melanosomes. Once mature, melanosomes are transferred to neighbor keratinocytes and transported to the apical area of the cell where they form the protective melanin cap. Skin pigmentation results from three sequential processes: (i) the biogenesis of melanin in melanocytes; (ii) the transport from its site of synthesis in the perinuclear area of the cell to the periphery; and finally, (iii) the transfer to receptor keratinocytes. In this work, we focused on the transfer of melanin. Previous studies from our group support the model of coupled exo-endocytosis of melanin transfer from melanocytes to keratinocytes. As Rab GTPases are master regulators of intracellular trafficking and have already been implicated in several steps of skin pigmentation (melanogenesis and transfer of melanin), the group proposed to continue investigating the molecular mechanisms of the melanin transfer and found that Rab11b mediates the exocytosis and transfer of melanin from melanocytes to keratinocytes. The aim of this work is to identify Rab11b effectors, which bind to the active form of small GTPases, in melanocytes. Since Rab11-family interacting proteins (Rab11-FIPs) are described to be effectors of Rab11, we studied if they could have a role in the secretion of melanin from melanocytes. Moreover, this analysis was done downregulating each protein and observing if there was a decrease in melanin exocytosis. We found that FIP2 as well as Myosin Va can play a role in this process, since the silencing of each of these proteins impaired melanin secretion by melanocytes. Furthermore, we analyzed the localization of each FIP as well as Myosin Va in melanocytes by overexpressed tagged forms of these proteins. We also analyzed a possible association between these proteins and melanosomes. Relatively to FIP2, we found that this protein co-localize with Rab11b, when both overexpressed, in close proximity with melanosomes along of cytoplasmic membrane. Myosin Va also co-localize with Rab11b but in dendrite tips of melanocytes. At this point, the disposition of FIP3 also gave us good evidences to play a role in melanin secretion. FIP3 co-localize with Rab11b, when both proteins overexpressed, in microtubule-organizing center, changing the normal localization of Rab11b in the cell. Melanosomes also change its disposition, becoming dispersed in all cytoplasmic region. In summary, our studies indicate that FIP2, FIP3 and Myosin Va are required for the secretion of melanin by melanocytes.
A pele é o maior órgão do corpo humano e desde sempre a sua pigmentação foi um fator intrigante. Diversas doenças têm sido diagnosticadas e associadas às várias alterações que ocorrem ao nível da pigmentação da pele, maioritariamente hipopigmentação, como a Síndrome de Griscelli, a Síndrome de Hermansky-Pudlak ou mesmo a Síndrome de Waardenburg. Tem havido também um enorme desenvolvimento do mercado das indústrias farmacêuticas e de cosméticos na área da pigmentação da pele, com um contributo na investigação nesta área. Assim, é essencial perceber os mecanismos moleculares que ocorrem nas células envolvidas na pigmentação da pele, de modo a possibilitar um real desenvolvimento de tratamentos que solucionem ou atenuem os sintomas destas doenças. A “unidade melano-epidérmica” é um complexo que tem a capacidade de conferir cor e propriedades foto-protetoras à pele. Esta unidade é constituída por duas classes de células distintas: os melanócitos e os queratinócitos. Os melanócitos são células epidérmicas altamente especializadas e com a capacidade de sintetizar e armazenar pigmento (melanina) em organelos denominados melanossomas. Uma vez maduros, os melanossomas são transferidos para os queratinócitos adjacentes, nos quais se deslocam para a zona perinuclear apical onde formam um escudo protetor, de modo a conferir a proteção necessária para evitar danos causados no DNA pela radiação ultravioleta. Deste modo, podemos dizer que a pigmentação da pele decorre de três processos essenciais: (i) a biogénese da melanina (melanogénese) e consequente armazenamento nos melanócitos; (ii) transporte dos melanossomas desde o local de síntese, na zona perinuclear da célula, para a periferia; e (iii) transferência dos melanossomas para os queratinócitos adjacentes. Estudos anteriores realizados pelo nosso grupo, verificaram que a transferência dos melanossomas ocorre maioritariamente através do modelo baseado na exocitose a partir dos melanócitos e posterior endocitose pelos queratinócitos. Além disso, baseando-se no facto das proteínas Rab serem os principais reguladores do tráfego membranar e estando envolvidas em diversas etapas do processo de pigmentação da pele, o grupo propôs-se a continuar o estudo minucioso dos mecanismos moleculares da pigmentação da pele. Assim, foi demonstrado que a proteína Rab11b está envolvida na exocitose e na transferência da melanina dos melanócitos para os queratinócitos. Foi ainda demonstrado que a Rab11b co-localiza com o receptor de transferrina na região perinuclear da célula, indicando que marca maioritariamente os endossomas de reciclagem. Ainda assim, vesículas positivas para Rab11b foram vistas a co-localizar com melanossomas maduros na região periférica da célula. O principal objetivo deste trabalho parte precisamente deste resultado que envolve a proteína Rab11b. De modo a dar continuidade ao mesmo, o grupo propôs-se a identificar e seguidamente estudar proteínas que pudessem estar envolvidas com a Rab11b na exocitose dos melanossomas. Estas proteínas são designadas efetores e interagem com proteínas G específicas, ajudando-as a desempenharem as suas funções, quando estas se encontram no seu estado ativo, ou seja, ligadas a GTP. Neste sentido, inicialmente procurámos identificar estas proteínas efetoras da Rab11b através da bibliografia mas também através da técnica “Yeast-two-Hybrid”. Por conseguinte, foram identificadas “Rab11-family interacting proteins”, também designadas Rab11-FIPs e a Miosina Va como as mais promissoras candidatas a interagir com a Rab11b. Seguidamente, o nosso objetivo era observar se aquando do silenciamento de cada um dos genes codificadores de cada proteína existiria ou não uma diminuição na secreção de melanina por parte dos melanócitos. Ou seja, investigar a existência dum fenótipo semelhante ao provocado aquando do silenciamento do gene que codifica a proteína Rab11b. Deste modo, foi demonstrado que a FIP2 poderá estar envolvida neste processo, tendo sido, a par da Miosina Va as proteínas que se apresentaram mais próximas do fenótipo descrito para o silenciamento da Rab11b quando silenciadas nos melanócitos. Contudo, abordamos estes resultados apenas como preliminares devido a algumas dificuldades detetadas na quantificação da melanina segregada. Tendo a FIP2 e a Miosina Va como principais alvos do nosso estudo mas sem poder descartar as restantes proteínas estudadas, iniciámos então a caracterização das mesmas. Para isso, foi essencial sobre-expressar cada uma das FIPs e a Miosina Va sozinhas mas também em simultâneo com a Rab11b, de modo a verificar a existência ou não de co-localização. De modo a complementar o estudo, comparámos também localização de cada proteína estudada com a localização dos melanossomas nos melanócitos, verificando se a proximidade já detetada entre os melanossomas e a Rab11b também se verifica com as FIPs e a Miosina Va. Foi facilmente visualizada a existência de co-localização entre as FIPs e Miosina Va com a Rab11b. Contudo, para cada uma delas foi verificado que esta co-localização se verifica em locais distintos da célula, nuns casos mais próximos do compartimento endocítico de reciclagem (FIP3) e noutros com elevada proximidade à membrana plasmática (FIP2), principalmente nas dendrites do melanócito (Miosina Va). Se do ensaio de exocitose de melanina obtivemos dois alvos preliminares (FIP2 e Miosina Va), observando a localização das FIPs também visualizámos um efeito interessante por parte da sobre-expressão da FIP3 e da sua influência na localização da Rab11b. Isto levou a que fosse também considerada como um potencial alvo para estudos futuros. Os resultados obtidos no decorrer desta investigação permitem-nos obter informações adicionais sobre os mecanismos moleculares que regulam a transferência de melanina dos melanócitos para os queratinócitos. Em concreto, este trabalho define possíveis alvos, como a FIP2 e a FIP3, envolvidos nos mecanismos que levam ao transporte e consequente exocitose da melanina dos melanócitos. Os resultados fornecem também boas indicações acerca da influência da Miosina Va no sistema de pigmentação, sendo já conhecida a sua influência nos filamentos de actina, na periferia dos melanócitos. Sugerimos também novos elementos de estudo, principalmente relacionados com o complexo tripartido FIP2-Rab11a-Miosina Vb. Sabendo que a Rab11a quando silenciada não afeta significativamente a exocitose da melanina, contrariamente à Rab11b, podemos colocar a hipótese que a Miosina Vb poderá ter um efeito determinante juntamente com a FIP2 e Rab11b neste processo. Isto principalmente junto da membrana plasmática onde a FIP2 co-localiza com a Rab11b e ambas se encontram adjacentes aos melanossomas. A FIP3, por sua vez, é também interessante pela capacidade que tem em recrutar a Rab11b para o compartimento endocítico de reciclagem, aquando da sobre-expressão de ambas, deixando de se localizar em qualquer outro local da célula. Parece também existir nestas condições um movimento centrípeto dos melanossomas que torna interessante analisar a capacidade de secreção de melanina por parte do melanócito após sobre-expressar esta FIP. Mais estudos serão necessários para comprovar a possível influência das duas FIPs selecionadas neste modelo de pigmentação. Será também necessário desenvolver um novo método de quantificação da melanina, mais eficaz e preciso, ou melhorar o já utilizado por nós, evitando a minuciosidade, ambiguidade e a demasiada sensibilidade do mesmo. Neste aspeto algumas soluções também são propostas para o efeito sendo que outras foram analisadas, testadas e apresentadas no decorrer da tese. É importante ter sempre em conta que os resultados e hipóteses para estudos futuros aqui apresentados por nós têm como objetivo primordial melhorar a compreensão dos mecanismos moleculares de pigmentação da pele, permitindo assim servir de base para melhor compreender e interpretar as razões que levam aos diferentes fenótipos das doenças da pigmentação.
Descrição: Tese de mestrado, Biologia (Biologia Molecular e Genética), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015
URI: http://hdl.handle.net/10451/20841
Designação: Tese de mestrado em Biologia (Biologia Molecular e Genética)
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