Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/22288
Título: Validation of voltage-gated sodium channels from dorsal root ganglia neurons as a pharmacological target for the treatment of chronic pain
Autor: Serrão, Joana Maria Monteiro
Orientador: Lima, Pedro A.
Palavras-chave: Dor crónica
Canais de sódio ativados pela voltagem
Novo alvo terapêutico
Neurónios do gânglio da raiz dorsal
Comportamento animal
Teses de mestrado - 2015
Data de Defesa: 2015
Resumo: A capacidade de um indivíduo percecionar estímulos dolorosos é de extrema importância. Ao sentir ou associar uma situação a uma experiência dolorosa, o indivíduo pode adotar posturas protetoras, de forma a evitar possíveis danos causados pela situação eminente e/ou futuras situações semelhantes. Os mecanismos moleculares inerentes à deteção de estímulos (mecânicos, térmicos ou químicos) e capazes de codificar dor pelos neurónios sensoriais primários (nocicetores) integram o fenómeno de nociceção. Contudo, em situações fisiopatológicas, é possível que os doentes desenvolvam Dor crónica (DC), uma síndrome em que a perceção da dor é exacerbada e os doentes sofrem de hiperalgesia (reação exagerada a um estímulo doloroso), alodinia (sensação de dor a um estímulo não doloroso), dor espontânea, parestesia (sensação anormal) e disestesia (parestesia desconfortável). A DC afeta mais de 20% da população Humana e as suas etiologias são variadas: trauma, doenças autoimunes e metabólicas, infeções, tratamento antirretroviral e quimioterapia. Apesar da grande incidência, atualmente não existe uma abordagem terapêutica eficiente que possa suplantar as necessidades dos doentes, o que agrava as consequências psicológicas, sociais e económicas desta patologia. Os atuais tratamentos farmacológicos variam entre anti-inflamatórios não esteróides, opióides, antidepressivos e anticonvulsivos que, para além de frequentemente não serem eficientes, estão associados a efeitos secundários indesejáveis como a dependência, habituação ou até mesmo a perda da capacidade de gestão da dor. As fibras nervosas C e Aδ transmitem eletricamente os estímulos sensoriais, a velocidade de transmissão nas fibras C (0,5-2m-1∙s), devido à ausência de um revestimento de mielina, é consideravelmente mais lenta, comparando à velocidade de transmissão das fibras Aδ (6-30 m-1∙s). A perceção dos estímulos transmitidos pelas fibras C é difusa, ao passo que os transmitidos pelas fibras Aδ são percecionados como bem localizados. Todas as fibras nocicetivas são constituídas pelos neurónios do gânglio da raiz dorsal (DRG, do inglês Dorsal Root Ganglia). Estes últimos são classificados de acordo com o seu diâmetro em pequeno (27-31μm), médio (31-40μm) e grande (40-50μm); e possuem uma anatomia pseudounipolar, com um longo axónio que inerva a periferia do organismo e um axónio mais curto que se dirige para o corno da raiz dorsal da medula espinal e o corpo celular alojado em locais específicos no interior da coluna vertebral. Os conjuntos dos corpos celulares destes neurónios é então designado de gânglio da raiz dorsal e a sua localização dentro da coluna vertebral é específica às fibras aferentes correspondentes. Dado o foco da presente dissertação, será dada uma especial atenção aos neurónios-DRG de pequeno e médio diâmetro integrantes da nociceção, que compõem as fibras C e Aδ, respetivamente. Em situações fisiológicas, na ausência de estímulos capazes de produzir dor, os nocicetores encontram-se quiescentes, sem qualquer informação a ser transmitida. No entanto, na presença destes estímulos, os recetores nas terminações nervosas dos neurónios primários podem ser ativados. Quando o estímulo tem uma magnitude maior do que o limiar de ativação das fibras nervosas, é produzido um potencial de ação, que percorre a fibra nervosa, terminando nas lâminas I e II no interior do corno da raiz dorsal da medula espinal. A partir daí, a informação é transmitida para os neurónios secundários, para de seguida ser transmitida ao sistema nervoso central, onde no córtex sensorial do cérebro, a informação a relativa à quantificação e localização da dor é integrada. A geração e transmissão de potenciais de ação é particularmente devida à ativação dos canais de sódio (Na+) ativados pela voltagem (VGSC, do inglês voltage-gated sodium channels) presentes ao longo de todo o neurónio-DRG. Até à data estão identificadas nove isoformas diferentes de VGSC (Nav1.1-9), que diferem nas propriedades eletrofisiológicas e distribuição corporal. As isoformas Nav1.7, Nav1.8 e Nav1.9 encontram-se preferencialmente distribuídas nos neurónios-DRG responsáveis pela transmissão nocicetiva. Patologias relacionadas com a perda ou o ganho de função dos genes que codificam para o Nav1.7 e Nav1.8 estão associadas a anomalias na perceção de dor, nomeadamente hipo ou hipersensibilidade. Ainda existe muito por se desvendar na fisiopatologia da DC, no entanto, sabe-se que os neurónios-DRG se encontram hiperexcitáveis neste contexto, comparativamente a situações fisiológicas. Estudos anteriores têm evidenciado alterações nos canais iónicos ativados pela voltagem, nomeadamente VGSC, que levam a esse estado de hiperexcitabilidade nestes neurónios. A estratégica terapêutica alternativa mais promissora para tratar DC visa a redução dessa “hiperexcitabilidade neural” que pode ocorrer através da alteração do funcionamento de canais-iónicos-chave que modulam a atividade elétrica desses neurónios. O conhecimento sobre as correntes iónicas subjacentes ao funcionamento de determinados canais é assim preponderante. Os canais/correntes especificamente implicados na DC carecem ainda de um conhecimento mais aprofundado e da sua validação como potenciais alvos terapêuticos. A presente dissertação objetiva o estudo das características eletrofisiológicas das correntes de Na+, com direta relevância para a DC em neurónios-DRG de pequeno diâmetro, através do estudo da biofísica e expressão destes canais. Para tal, e uma vez que a DC pode ter várias etiologias, esta síndrome foi estudada no contexto de origem inflamatória e neuropática, baseando-se em modelos animais de dor em ratos. A DC inflamatória foi estudada através da indução de monoartrite no joelho do rato (ipsilateral), pela injeção de uma substância que ativa o sistema imunitário: Complete Freund’s Adjuvant (CFA). No caso da dor neuropática, usou-se o muito comum modelo Chronic Constriction Injury (CCI), que assenta na constrição crónica do nervo isquiático do rato (ipsilateral), ao nível da coxa, através de quatro nós soltos em torno do mesmo realizados cirurgicamente. O desenvolvimento de DC em ambos os modelos foi acompanhado ao longo do tempo através de testes comportamentais. Estes testes permitiram a observação do aparecimento de posturas putativas de evidenciarem dor espontânea em ratos. Foi também realizado o estudo do desenvolvimento de hiperalgesia, através da observação de reflexos protetores quando os ratos eram submetidos a estímulos mecânicos aplicados na pata e da alodinia ao frio, quando era aplicada acetona também na pata. No modelo inflamatório foi observada uma maior sensibilidade nos primeiros dias após a indução de dor, tendo os ratos apresentado uma recuperação parcial da sensibilidade no final do tempo de progressão do modelo. No modelo neuropático, os ratos modelo desenvolveram hiperalgesia durante o curso da experiência, durante o qual também desenvolveram alodinia ao frio. Ao fim de 21 e 28 dias após a indução de dor, nos modelos inflamatório e neuropático, respetivamente, os ratos foram sacrificados e os DRGs, foram coletados para futuras experiências. As propriedades biofísicas das correntes de Na+ foram estudadas por registos eletrofisiológicos em neurónios-DRG de pequeno diâmetro isolados, obtidos a partir de preparações ex-vivo de ratos controlo e dos modelos de DC. No estudo da DC inflamatória não se observaram diferenças significativas entre as correntes de Na+ provenientes de neurónios de ratos controlo e de dor. No entanto, no caso do estudo da dor neuropática, observaram-se algumas tendências: a densidade da corrente de Na+ que flui pela área membrana celular é maior nos neurónios-DRG provenientes dos ratos CCI e o tempo que essas mesmas correntes demoram a recuperar a sua magnitude após a inativação dos VGSC é também menor. Estas alterações biofísicas podem ser a razão pela qual, no contexto de DC, os neurónios encontram-se hiperexcitáveis e conseguem suportar uma maior frequência de disparo dos potenciais de ação. É importante referir que trabalhos anteriores demonstraram que o Nav1.8 é a isoforma presente em situações fisiológicas nos pequenos neurónios DRG, com um perfil eletrofisiológico que mais se adequa a estas alterações observadas. Paralelamente, a expressão proteica dos canais de sódio Nav1.7 e Nav1.8 foi comparada entre os gânglios do lado ipsilateral (sujeitos ao modelo de dor) e do lado contralateral (controlo interno) à indução de dor. Pela análise por Western blot, observou-se um aumento da expressão de Nav1.7 e Nav1.8 nos gânglios ipsilaterais dos ratos com dor neuropática (CCI). Por análise imunohistoquímica, observou-se que estes canais são expressos nos neurónios DRG e que poderá existir um aumento da expressão de Nav1.7 nos gânglios do lado ipsilateral no modelo inflamatório (CFA), quando comparados com os gânglios contralaterais. Em resumo, a presente dissertação permitiu observar que neurónios-DRG de pequeno diâmetro sofrem alterações na DC, nomeadamente nas propriedades biofísicas e de expressão dos VGSC. No futuro serão necessários mais ensaios eletrofisiológicos que discriminem dentro das correntes totais de Na+, quais as isoformas dos VGSC presentes nos neurónios DRG que induzem a modificações na sua excitabilidade. Deste modo, poder-se-á compreender quais os padrões-tipo de atividade bem como as diferenças a nível funcional dos neurónios provenientes de ratos com dor comparativamente aos controlos. Serão também necessárias mais análises de expressão dos VGSC nos DRGs destes modelos de dor, para um melhor entendimento das tendências observadas. Deste modo, espera-se que uma mais consistente validação dos neurónios DRG como alvo farmacológico e, em particular dos VGSC por estes expressos, tragam informações relevantes para o desenvolvimento de novas terapias para a DC. Idealmente, o fármaco permitiria aos pacientes a recuperação da excitabilidade fisiológica destes neurónios, sem atuar no sistema nervoso central, evitando efeitos secundários indesejáveis e conferido aos pacientes uma melhor qualidade de vida.
Chronic pain (CP) affects 21% of the human population and to date there is still no adequate treatment for this syndrome. Previous studies have indicated dorsal root ganglia (DRG) neurons, as crucial for the transmission of pain stimulus. The activity of these neurons leads to brain perception of pain, which is found to be exacerbated in CP patients. Such condition derives from the abnormal function of pivotal ion channels that shape the electric activity in DRG neurons. Therefore, the most promising therapeutic approach for CP relies on reducing this neuronal hyperexcitability. In this regard, voltage-gated Sodium channels (VGSC) have the ability to initiate the electrical signalling in excitable cells, a characteristic that makes them potential drug targets. The peripheral localization of DRG neurons and its preferential expression of the Sodium channel isoforms Nav1.7, Nav1.8 and Nav1.9, makes them key targets for the development of novel analgesics to treat CP. Nevertheless, there is still a great demand for novel functional studies of those currents/channels sub-types specifically involved in the processes of CP, namely neuropathic and inflammatory pain. The aim of this project was to study alterations in VGSC currents/channels in DRG neurons from rat models of neuropathic and inflammatory CP; specifically, to identify the biophysical and pharmacologic patterns that change following CP and correlating those with animal behaviour tests. Overall, results show development of hyperalgesia and an abnormal function and expression of VGSC in DRG neurons following neuropathic pain in rat models, contributing to the validation of VGSC in DRG neurons as potential targets for novel analgesics in CP.
Descrição: Tese de mestrado, Bioquímica, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015
URI: http://hdl.handle.net/10451/22288
Designação: Tese de mestrado em Bioquímica
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