Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/22290
Título: Role of neurotrophic factor receptors in Innate Lymphoid Cell immunity
Autor: Almeida, Luís Miguel Ferreira de
Orientador: Ibiza, Sales
Telhada, Maria Margarida Blasques, 1951-
Palavras-chave: RET
Innate lymphoid cells
Interleukin-22
Epithelial reactivity
Intestinal organoids
Teses de mestrado - 2015
Data de Defesa: 2015
Resumo: O intestino humano é considerado o maior compartimento do sistema imunitário, tendo constantemente de enfrentar e responder de forma eficiente a sinais e perigos externos, como antigénios e moléculas imunomodulatórias provenientes de várias fontes, incluindo o nosso próprio microbioma intestinal (1). Isto deve-se ao lúmen intestinal estar em contato direto com tudo aquilo que é ingerido, funcionando como uma porta seletiva entre o meio-ambiente e o corpo e até mesmo como um potencial nicho onde bactérias patogénicas se podem desenvolver e levar a situações de doença, podendo inclusive ser considerado uma parte exterior do nosso corpo. Adicionalmente, o sistema imunitário tem de integrar e modular os sinais provenientes do microbioma intestinal, que coevoluiu com os seus hospedeiros, estabelecendo uma relação simbiótica com eles de várias formas (2, 3), ajudando na manutenção da homeostasia, metabolizando compostos que de outra forma seriam indigeríveis, competindo e prevenindo que outras bactérias colonizem o trato intestinal e sendo até capaz de modular o próprio sistema imunitário (4). Em troca, nós oferecemos-lhes uma fonte estável e constante de nutrientes e um ambiente relativamente estável onde podem crescer e proliferar. (4). No entanto, em certas condições, quando o sistema imunitário não consegue regular e controlar devidamente as bactérias comensais, algumas delas podem tornar-se patogénicas (5). Ainda assim, é notável a forma como o sistema imunitário consegue lidar simultaneamente com as bactérias comensais e bactérias patogénicas, de forma a garantir a homeostasia intestinal em situações simultaneamente tão semelhantes e diversas. É fácil de imaginar que o que observamos hoje em dia foi o resultado de uma enorme pressão evolutiva para garantir o bom funcionamento do nosso sistema imunitário intestinal. Entre as várias células que fazem parte do sistema imune inato e adaptativo e que têm um papel fundamental na regulação e manutenção da homeostasia, existe uma família emergente de células inatas de morfologia linfoide, as Innate Lymphoid Cells (ILCs). O seu papel em processos biológicos tem vindo a ser revelado ao longo destes últimos anos. Sabe-se atualmente que as ILCs tem um papel na iniciação, mediação e resolução de estados inflamatórios, integram sinais do microbioma, têm um papel na formação e reparação de órgãos linfoides, reconhecem e produzem citocinas imunomodulatórias e são inclusive capazes de modular a resposta do sistema imune adaptativo. As ILCs identificam-se pela ausência de marcadores clássicos de células B, T, mieloides ou granulócitos. No entanto, expressam alguns marcadores presentes noutros leucócitos, como no caso da cadeia gamma (γc, CD132), IL-7Rα (CD127), IL-2Rα (CD25), e Thy1 (CD90). Esta família de células foi recentemente dividida em 3 grupos, de acordo com a expressão de fatores de transcrição específicos e perfis de expressão de citocinas. Atualmente, considera-se existirem ILCs de tipo 1, 2 e 3 (6-14). As ILCs de tipo 3 são um grupo relativamente heterogéneo de células, encontrando-se divididas em ILC3s e em células Lymphoid Tissue Inducer (células LTi). Estas células fazem parte do sistema imunitário das mucosas, estando presentes no intestino delgado e grosso e sendo produtoras de IL-22 (15). As ILC3s são definidas em ratinhos como sendo Lin- RORγt+ (e também Thy1+ IL-7Rαint C-Kitint CCR6-, com uma percentagem sendo NKp46+), enquanto que as células LTi são caracterizadas como Lin- RORγt+ NKp46- (e também Thy1+ IL-7Rαhi C-Kithi CXCR5+ CCR6+), com uma percentagem sendo CD4+. Este subtipo de células foi considerado como o grupo mais importante na produção de IL-22 numa situação de estado estacionário (16) e como tendo um papel extremamente importante na organogénese linfoide no feto (17-19), sendo ainda potentes produtores de IL-22 na fase adulta em ratinhos (20). No nosso laboratório, foi verificado que estas células expressam um recetor de fatores neurotróficos – RET (21). Também observámos que a percentagem de ILC3s IL-22+ se encontra reduzida em ratinhos com uma deleção condicional de RET em células RORγt+ (Rorc-Cre Retflox/flox). Estes ratinhos foram denominados RetΔ. Em contraste, ratinhos com uma mutação genética em que existe um ganho de função de RET (RetMEN2B/MEN2B), em que o recetor se encontra ativo de forma constitutiva, apresentavam uma maior percentagem de ILC3s IL-22+. Isto correlacionou-se com a reatividade epitelial destes ratinhos, sendo que a ausência de RET especificamente em ILC3s levava a que existisse uma menor expressão de genes associados à integridade epitelial. Pelo contrário, ativação constitutiva de RET levava a que existisse uma maior expressão de genes associados à reatividade epitelial. Isto fez-nos pensar que o RET tem um papel na produção de IL-22 em ILC3s, e que seria essa proteína a principal responsável pelas diferenças observadas, o que faz sentido se tivermos em conta o efeito que a IL-22 tem no epitélio. Esta proteína está descrita como tendo um papel antimicrobiano, regeneração de feridas e tecidos (22-24) e como sendo necessária para evitar a disseminação microbiana. (8, 25) Com este trabalho, pretendemos portanto analisar se era esta alteração na produção de IL-22 que levava às diferenças observadas entre ratinhos mutantes e wild type, e não outro fator (igualmente dependente de RET) que não estava a ser tido em conta. Para conseguir isto, decidimos inicialmente induzir a produção de IL-22 em células ILC3 de ratinhos RetΔ de forma independente de RET, e verificar se seria possível “recuperar o fenótipo” observado em ratinhos wild type. Para tal, criámos um vírus capaz de infetar este tipo de células e induzir uma produção constitutiva de IL-22. Embora tenhamos conseguido infetar uma percentagem de ILC3s, tendo efetivamente desenvolvido, de acordo com o nosso conhecimento, o primeiro método para inserir genes neste tipo de células, o processo é relativamente stressante para as mesmas e não nos foi possível recuperar um número suficiente de células para realizar um ensaio in vivo. Paralelamente, desenhámos um método in vitro que nos permitiu estudar a interação de ILC3s com o epitélio intestinal. Foi-nos possível purificar estas células diretamente de ratinhos e realizar uma co-cultura com organoides intestinais (também conhecidos como “mini guts” - modelos ex-vivo do epitélio (26)), medindo a expressão de vários genes que são upregulated pela IL-22. Foi possível observar uma upregulation bastante evidente de alguns destes genes após uma co-cultura com ILC3s de ratinhos wild type, tanto constitutivamente como após uma estimulação com IL-23, o que nos permitiu validar o método de co-cultura e mostrar que as ILC3s tinham, de forma autónoma, a capacidade de estimular um aumento na reatividade epitelial. Esta estimulação encontrava-se bastante reduzida na presença de um anticorpo capaz de neutralizar o efeito de IL-22, o que indica que os efeitos observados dependiam diretamente da atividade de IL-22. De seguida, estimulámos as células com ligandos de RET, e conseguimos observar um aumento na expressão destes mesmos genes, encontrando-se igualmente reduzida na presença do anticorpo anti-IL-22. Este efeito não se verificou em células cuja expressão de RET se encontrava afetada, o que fortaleceu a hipótese de que esta citocina é o fator que se encontra downstream de RET e que é responsável pelas alterações verificadas na reatividade epitelial de ratinhos com mutações neste recetor, indicando portanto que o RET tem um papel na produção de IL-22 em ILC3s e que essa produção está afetada quando a função de RET se encontra alterada, pelo que esta é a causa pelos diferentes fenótipos observados e descritos anteriormente.
The mammalian immune system has evolved to simultaneously allow for a peaceful cohabitation with the beneficial commensal bacteria, to provide defense against infectious agents and to initiate the repair and remodeling processes that restore and maintain tissue homeostasis. Innate lymphoid cells (ILCs) are an emergent family of effector immune cells which display a lymphoid morphology, lack rearranged antigen receptors and are most abundant at mucosal surfaces. The combined expression of lineage-specific transcription factors along with specific cytokine profiles led to the formal classification of this family in three distinct ILC subsets: Group 1, 2 and 3 ILCs. In the lab, it had previously been shown that RORγt+ ILC3s express the neurotrophic factor receptor RET. Furthermore, when the guts from RetGFP/+ mice (where GFP is knocked-in in the Ret locus) were analyzed by stereo microscopy, it was observed that GFP+ cells were located in aggregates, called Cryptopatches (CPs). It was also shown that RET is dispensable for the development of ILC3s (data not shown). We have then shown that mice with a specific Ret deletion in RORγt-expressing cells (RetΔ) show a decreased IL-22 production by ILC3s. Accordingly, mice with a gain-of-function mutant form of RET (RetMEN2B, where RET is constitutively active) have an increased percentage of IL-22+ ILC3s. Since IL-22 is known to induce the production of proteins and peptides (such as mucins and antimicrobial peptides) important for the maintenance of the epithelial barrier, we have also analyzed the gut of RetΔ and RetMEN2B mice and have found a strong reduction in the expression at the mRNA level of those genes in RetΔ mice and a marked increase in their expression in RetMEN2B mice. This data has shown that RET has a role in controlling innate IL-22 production and that the RET expression/activity modulates the epithelial reactivity. We hypothesized that IL-22 was the link between RET and the changes in epithelial reactivity. In order to prove this, we have developed a virus capable of infecting these cells and inducing the constitutive expression of IL-22 in both RetΔ cells and Wild type (WT) cells, since we were interested in recovering the expression of IL-22 that is partially lost in cells that lack RET. In theory, this would allow us to recover the expression of genes that are upregulated by IL-22 either in vivo or in vitro. This would provide strong evidence that IL-22 is the molecular link downstream of RET, being directly responsible for controlling the epithelial reactivity. We were able to develop a method of ILC3s transduction (to the best of our knowledge, the first one), but it was not efficient enough for our planned in vivo trials. In parallel, we have developed a novel co-culture system of intestinal organoids and ILC3s that allows us to study the interaction between them. The model was validated both by a rIL-22 stimulation and by a standard IL-23 stimulation of ILC3s, which showed that IL-22 is able to have a measurable effect on intestinal organoids and that stimulation of ILC3s was sufficient to increase some epithelial reactivity-related genes in this system in an IL-22-dependent manner. We have also shown than RET stimulation is enough to induce the upregulation of those same genes. This upregulation was reduced in the presence of an IL-22-neutralizing antibody, which indicates that ILC3-autonomous RET signals are able to modulate the epithelial reactivity, maintaining the integrity of the epithelial barrier in an IL-22-dependent manner.
Descrição: Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015
URI: http://hdl.handle.net/10451/22290
Designação: Tese de mestrado em Bioquímica (Bioquímica Médica)
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