Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/2271
Título: Characterization and functional analysis of the Gp1 accessory lysis protein in Mycobacterium smegmatis infection by the Mycobacteriophage Ms6
Autor: Catalão, Maria João Gracias Fernandes da Costa, 1979-
Orientador: Pimentel, Madalena Maria Vilela, 1961-
Pereira, J. Moniz, 1949-
Palavras-chave: Microbiologia
Teses de doutoramento - 2010
Data de Defesa: 2010
Resumo: The majority of phages described to date (≈96%) is endowed with a tail and presents a double-stranded DNA (dsDNA) genome. Each infection cycle terminates with the strictly programmed and regulated lysis of the host brought about by two phage-encoded proteins, a murein-degrading enzyme, the endolysin, which is essential in achieving rapid hydrolysis of cell wall peptidoglycan, and a second membrane-embedded protein, the holin, which serves to release or activate the endolysin at a precisely defined time, thus bringing about an effective burst of the infected host. Targeting of endolysins to peptidoglycan can be achieved in two ways: through pore formation by canonical holins at a defined time or by continuous export of endolysins endowed with export signals during synthesis, assisted by the host Sec translocon. Mycobacteriophage Ms6 is a temperate bacteriophage that infects Mycobacterium smegmatis and possesses an unusual lytic cassette: in addition to the endolysin-holin lysis system encoded by genes lysA (gp2) and hol (gp4) respectively, the Ms6 lytic cassette comprises three accessory lysis proteins encoded by genes gp1, gp3 (lysB) and gp5 that are restricted to mycobacteriophages. Mycobacteria are Gram-positive bacteria that have evolved a complex cell wall, comprising a peptidoglycan-arabinogalactan polymer with covalently bound mycolic acids of considerable size, a variety of extractable lipids, and pore-forming proteins which provide an extraordinary efficient permeability barrier to noxious compounds and contribute to the high intrinsic resistance of mycobacteria to many drugs. To overcome the disadvantage that a complex cell wall may represents for a successful infective cycle, mycobacteriophages have evolved new lysis strategies by acquiring, through their evolution, genes that likely confer a substantial selective advantage over those without them by providing faster and more complete lysis. The present work underscores a new model for endolysin export in mycobacteriophage Ms6. Several lines of evidence indicate that gp1 encodes a secretion chaperone-like protein that binds the endolysin, assists the export to the extracytoplasmic environment independently of holin function and is required to accomplish an efficient lysis of M. smegmatis. Construction of different Ms6 derivatives deleted in different regions of the lysis operon demonstrated that the gene products of hol and gp5, although nonessential for phage viability, appear to play a role in controlling the timing of lysis. Remarkably, during M. smegmatis infection two endolysin forms (Lysin384 and Lysin241) are synthesized and both enzymes were shown to be essential for the normal timing, progression and completion of host cell lysis. In conclusion, this work highlights the role of the accessory lysis protein Gp1 and revealed alternative pathways for mycobacteria lysis, demonstrating that the presence of the mycobacterium-specific lysis factor Gp1, may confer a selective advantage not only for fitness under different environmental conditions but also as an alternative to lysis exclusively holin-dependent. Mycobacteriophages – Molecular chaperones – Holins – Endolysins - Lysis timing - Phage therapy - Mycobacteria
Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da tuberculose, permanece como uma das principais causas de morbilidade e mortalidade no mundo. Esta realidade alarmante despertou um interesse renovado nas possibilidades terapêuticas dos bacteriófagos (vírus que infectam bactérias) e das sua proteínas líticas devido à capacidade de libertarem a progenia viral através da lise da célula hospedeira. A maioria dos fagos descritos até à data (≈96%) apresenta cauda e um genoma de DNA de cadeia dupla. Para induzirem uma lise efectiva do hospedeiro, estes bacteriófagos utilizam a estratégia “holina-endolisina” e sintetizam uma enzima, a endolisina, essencial para a hidrólise rápida do peptidoglicano e uma segunda proteína membranar, a holina, que permite a libertação ou activação da endolisina num período de tempo bem definido. O bacteriófago Ms6 é um micobacteriófago temperado que infecta Mycobacterium smegmatis. Como acontece com todos os fagos de DNA de cadeia dupla, o seu operão lítico codifica para os dois genes essenciais para a lise do hospedeiro: a endolisina com actividade de amidase codificada pelo gene lysA (gp2) e a holina codificada pelo gene hol (gp4). Estes dois genes fazem parte de uma unidade de transcrição juntamente com os genes gp1, gp3 (lysB) e gp5. Estudos prévios demonstraram que a expressão dos dois primeiros genes do operão lítico (gp1 e lysA) na ausência da holina, é suficiente para induzir a lise de E. coli, um fenótipo não observado na ausência de gp1 ou com a expressão da endolisina apenas. gp1 é o primeiro gene do operão de lise do micobacteriófago Ms6 e encontra-se localizado imediatamente a montante da endolisina. Codifica para uma pequena proteína de 77 aminoácidos que apresenta similaridade apenas com outras proteínas de micobacteriófagos, com função desconhecida. Apesar da inibição do crescimento de E. coli quando a proteína Gp1 é sobreexpressa, a estrutura secundária da sua sequência de aminoácidos não apresenta as características estruturais das holinas. A grande maioria das endolisinas descritas não possui uma sequência sinal para a secreção e dependem inteiramente das holinas para serem libertadas para o peptidoglicano. No entanto, estudos realizados revelaram a presença de um péptido sinal em N-terminal nas endolisinas de alguns fagos que infectam bactérias Gram-positivas como por exemplo, os bacteriófagos fOg44 de Oenococcus oeni e φg1e de Lactobacillus plantarum. Para atingirem o peptidoglicano, as endolisinas destes fagos requerem a actividade do sistema de secreção Sec de E. coli para a sua exportação, e não a formação de lesões membranares pelas holinas. Particularmente interessante é o caso das endolisinas do fago P1 e 21 de E. coli que possuem uma sequência SAR (Signal-Arrest-Release Sequence) em N-terminal que lhes permite serem transportadas pelo sistema Sec até ao peptidoglicano. A análise bioinformática da sequência de aminoácidos de LysA não previu uma sequência sinal para a secreção não estando igualmente identificadas sequências SAR em endolisinas de outros micobateriófagos, o que parece indicar que a translocação desta proteína através da membrana citoplasmática está dependente dos outros genes de lise. No presente estudo, investigou-se o envolvimento da proteína acessória de lise Gp1 no transporte da endolisina através da membrana citoplasmática e a função das holinas Hol e Gp5 na regulação do tempo de lise em M. smegmatis. Foi também estudada a função da endolisina durante a infecção das micobactérias e o seu espectro de actividade lítica. Na primeira parte do trabalho, os resultados obtidos demonstraram que em E. coli a co-expressão das proteínas Gp1 e LysA (endolisina) é suficiente para obter um efeito lítico na ausência da holina. No entanto, Gp1 não pertence à classe das holinas, apresentando características estruturais e bioquímicas de chaperone molecular, como um baixo peso molecular (<15 kDa), um ponto isoeléctrico acídico e a capacidade de formação de dímeros. Experiências de interação de proteínas por crosslinking em E. coli, demonstraram que Gp1 interage com a endolisina LysA através de ligação com os primeiros 60 aminoácidos N-terminais da enzima, sendo esta região necessária e suficiente para a interacção. De facto, durante a infecção de M. smegmatis pelo Ms6 esta interacção também ocorre e a oligomerização de Gp1 parece ser necessária para este processo. A delecção de gp1 do operão de lise do bacteriófago Ms6 demonstrou que, embora Gp1 não seja essencial para a obtenção de um fenótipo de lise, é necessária para uma lise eficiente de M. smegmatis e para a libertação da progenia viral. Tendo em consideração que tanto em E. coli como em M. smegmatis, a holina não é necessária para a lise, a sua função durante o ciclo de infecção foi estudada. A análise da sequência aminoacídica de Hol revelou a presença na região N-terminal da proteína de uma sequência SAR seguida de uma região transmembranar, características das pinholinas. Investigou-se ainda a função da proteína Gp5, que embora possuindo também características estruturais de holina, não é essencial para a lise de M. smegmatis. Utilizando a técnica de recombineering, construiram-se diferentes fagos derivados do Ms6, deleccionados em diferentes genes líticos e estudou-se o efeito dessas delecções no seu ciclo de replicação após a infecção dos hospedeiro. Observou-se que Hol e Gp5, embora não sejam essenciais para a viabilidade do bacteriófago, parecem ter um papel na regulação do tempo de lise: a delecção de hol causou uma lise precoce enquanto que a delecção de gp5 retardou o tempo de lise. Por outro lado observou-se também que a presença de ambas as proteínas durante a infecção é essencial para obter a lise do hospedeiro no tempo de lise programado. Por fim, na terceira parte do trabalho, estudou-se a função durante o ciclo lítico das duas endolisinas (Lisina384 e Lisina241) codificadas pelo gene lysA. A análise da sequência nucleotídica de lysA revelou a presença de um gene de lise adicional codificado na mesma fase de leitura, e precedido por sinais de tradução (um codão de iniciação GTG e um local de ligação ao ribossoma). Embora a endolisina se tenha revelado essencial para a lise de M. smegmatis (um derivado do Ms6 deleccionado no gene lysA não é viável), bacteriófagos derivados do Ms6 defectivos na síntese da lisina384 ou da lisina241 embora sejam viáveis, apresentam um ciclo de infecção defectivo. A proteína Gp1 demonstrou ser essencial para a síntese ou estabilidade da lisina384 mas não da lisina241, embora não pareça participar na função final desta proteína, nem na sua activação ou conformação. Ambas as endolisinas possuem actividade lítica em diferentes bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e micobactérias quando adicionadas exogenamente. Em resumo, o presente trabalho demonstra a importância da proteína acessória de lise Gp1, não só na translocação da lisina384 através da membrana citoplasmática, mas também para uma lise eficiente de M. smegmatis. Por outro lado, estes estudos revelaram a existência, no micobacteriófago Ms6, de vias alternativas de lise através da presença, no seu genoma, de proteínas de lise adicionais (para além do sistema holina-endolisina) e exclusivas deste grupo de fagos. Devido à complexidade da parede celular micobacteriana e da barreira que poderá representar para um ciclo de infecção bem sucedido, estas proteínas de lise acessórias poderão conferir uma vantagem selectiva, não só em termos evolutivos durante a infecção em diferentes condições ambientais, mas também como uma alternativa viável para uma lise exclusivamente dependente da holina. A caracterização dos mecanismos de lise das micobactérias pelos micobacteriófagos e um conhecimento das vias exactas pelas quais as enzimas efectoras da lise são posicionadas junto do seu substracto, poderá contribuir para a identificação de novos alvos terapêuticos na parede das micobactérias. Micobacteriófagos – Tempo de lise – Chaperones moleculares – Holinas – Endolisinas – Terapia Fágica - Micobactérias
Descrição: Tese de doutoramento, Farmácia (Microbiologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2010
URI: http://hdl.handle.net/10451/2271
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