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Title: Optimização da determinação de ésteres de toxinas diarreicas e avaliação da sua citotoxicidade
Authors: Rodrigues, Susana Margarida Correia Alves, 1972-
Advisor: Oliveira, Nuno Guerreiro de, 1970-
Vale, Paulo, 1969-
Keywords: Toxicologia alimentar
Controlo de qualidade
Teses de mestrado
Issue Date: 2007
Abstract: O estudo da contaminação de moluscos bivalves com toxinas do tipo diarreico (DSP) foi realizado em amostras de diversas espécies da costa portuguesa, recorrendo à cromatografia líquida com detecção por espectrometria de massas (LC-MS). Os resultados revelaram que o ácido ocadáico (AO) e a dinofisistoxina-2 (DTX-2) se encontram maioritariamente na forma de ésteres acilo (DTX-3), sendo apenas detectados após a hidrólise alcalina dos extractos. O mexilhão e a conquilha constituíram uma excepção, pois o AO e a DTX-2 foram detectados, quer na forma livre, quer esterificada. Para estas duas espécies verificou-se que a percentagem de esterificação foi variável, aumentando com o total de toxinas DSP acumuladas pelos bivalves. Para as restantes espécies, os resultados revelaram que mais de 96% do AO e da DTX-2 se encontram na forma de ésteres acilo (DTX-3). Foi também objecto desta dissertação, a avaliação da estabilidade das toxinas DSP em tecidos homogeneizados e extractos metanólicos de duas espécies de bivalves congelados (amêijoa-macha e mexilhão). Este estudo foi efectuado durante quatro semanas, sendo que nas duas primeiras semanas se observou um decréscimo da concentração de DSP total em cerca de 20-25% nos tecidos e tendo a concentração destas toxinas estabilizado nas duas semanas seguintes. As perdas foram devidas à redução da fracção dos ésteres, enquanto que as toxinas livres não sofreram alterações significativas. Nos extractos metanólicos registaram-se perdas superiores. A optimização do processo de extracção das toxinas foi também objecto deste trabalho e revelou que uma solução de metanol a 90% é a mais eficiente. A reacção de hidrólise alcalina destinada a converter os ésteres em toxinas livres foi lenta e incompleta à temperatura ambiente. Para temperaturas iguais ou superiores a 60 ºC a reacção estava concluída a partir de 40 minutos. O estudo da concentração da base necessária para a hidrólise revelou que concentrações de hidróxido de sódio inferiores a 2,5 M resultaram numa libertação incompleta dos ésteres.Foi ainda avaliada a actividade citotóxica de extractos de berbigão e mexilhão naturalmente contaminados com toxinas DSP através de ensaios de sobrevivência celular realizados em células V79. Foram realizadas curvas de sobrevivência para o padrão de AO tendo-se obtido um LD50 de 27 nM. Os extractos não hidrolisados apresentaram uma toxicidade dependente da concentração de toxinas livres. A citotoxicidade representada pelos ésteres só foi evidenciada após a conversão destes em toxinas livres recorrendo à hidrólise. As curvas de sobrevivência dos extractos hidrolisados, quer para o berbigão, quer para o mexilhão, apresentaram valores de LD50 inferiores aos obtidos para o padrão de AO, reflectindo, assim, que para alguns extractos a concentração de DSP obtida por LC-MS foi inferior à estimada pelo ensaio de citotoxicidade. Estas diferenças poderão dever-se às metodologias ou à presença de outros compostos bioactivos naturais ou contaminantes ambientais.
Contamination of Portuguese shellfish with diarrhetic shellfish toxins (DSP) was studied in several shellfish species of the Portuguese coast by liquid chromatography with mass spectrometry detection (LC-MS). In all shellfish species okadaic acid (OA) and dinophysistoxin-2 (DTX-2) were found mainly in acyl form (DTX-3), being detected only after hydrolysis of shellfish extracts. Mussel (Mytilus edulis) and Donax clams (Donax spp) were an exception with OA and DTX-2 found either esterified and in free form. For these two species the percentage of acyl esters found was variable and increased with the total of DSP toxins accumulated by bivalves. In the remaining shellfish species more than 96% of OA and DTX-2 were found esterified. The stability of DSP toxins in naturally contaminated shellfish, either in tissue homogenates or in raw methanol extracts, was investigated in two different species (Venerupis pullastra and Mytilus edulis) frozen over a four week period. Losses of DSP toxins up to 20-25% ocurred in the first two weeks, but in the two remaining weeks no further decrease was observed. The decrease was due mainly from losses of OA and DTX-2 esters, the free toxins were stable over the period studied. DSP toxins were more stable in tissue than in raw methanol extracts. The optimization of analysis of esters was assessed by varying methanol ratios used for extraction, by studying the temperature and time of alkaline hidrolises reaction and concentration of base needed. Methanol ratios were tested from 70-100% and the highest DSP concentrations were obtained with 90% methanol. Temperature was tested from room temperature to 70ºC. At room temperature the reaction was slow and incomplete and from 60ºC forward the reaction was complete in 40 minutes. Concentrations of sodium hydroxide less than 2,5 M resulted in incomplete release of esters. Cytotoxicity activity of cockle and mussel extracts naturally contaminated with DSP toxins was evaluated by MTT assay on V79 cells. OA standard exhibited a dose dependent cytotoxic effect with a LD50 of 27 nM. The toxicity of unhidrolysed extracts was dependent on concentration of free toxins. Esters citotoxicity was evidenced only after conversion of esters into free toxins by alkaline hydrolysis. For hydrolysed extracts of cokles and mussels LD50 were lower than the LD50 obtained for OA standard. In some shellfish extracts the DSP concentrations estimated from cytotoxicity assays were higher than concentrations obtained by LC-MS. The differences may be inherent to methodological approaches themselves and/or toxicity from natural bioactive compounds or ambient contaminants.
Description: Tese de mestrado em Controlo de Qualidade e Toxicologia dos Alimentos apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Farmácia, 2007
URI: http://catalogo.ul.pt/F/?func=item-global&doc_library=ULB01&type=03&doc_number=000518474
http://hdl.handle.net/10451/231
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