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Título: The Eph/ephrin gene family in the european Amphioxus: an Evo-Devo approach
Autor: Bosne, Stéphanie Correia de Matos David,1987-
Orientador: Garcia Fernàndez, Jordi
Sucena, Élio
Palavras-chave: Biologia evolutiva
Filogenia
Embriologia
Teses de mestrado - 2010
Issue Date: 2010
Resumo: A Evolução e o Desenvolvimento (Evo-Devo) é uma area da biologia que tem por objectivo o estudo e a interpretação de conhecimentos de ambas as areas de evolução e da biologia do desenvolvimento. Tenta assim, explicar e testar as teorias evolutivas ao nivel morfologico. (David 2001) A transição de invertebados para vertebrados é um marco importante na historia evolutiva das especies. A relação filogenética no Filo Chordata é importante para compreender esta transição. O Filo é constituido de tres subfilos Vertebrata, Cephalocordata e Urochordata. As caracteristicas que os une neste Filo é a presença de uma notocorda, um tubo nervoso dorsal, tubo nervoso dorsal, fendas branquiais, um endostélio e uma cauda pós-anal, em pelo menos uma fase de sua vida. Contudo, a relação filogenética dentro do Filo Chordata foi controversa. No século XIX os urocordados foram colocados na base da filogenia do Filo, estando deste modo, os cefalocordados mais proximos dos vertebrados (Fig.1). No entanto, dados moleculares recentes levaram a reversao destas posições estipulando que os cefalocordados se separam antes, localizando-se basalmente ao grupo Urochordata-Vertebrata (Fig.1) (Delsuc 2006). O Filo Cephalochordata compreende dois generos (Branchiostoma and Epigonichtys). O anfioxo (Branchiostoma floridae - especie americana - Branchiostoma lanceolatum -especie europeia) possede uma faringe com fendas branquiais, uma cauda pos anal, um sistema circulatorio ausente de coração e um sistema excretor rudimentar (Fig.2). Contudo carecem de algumas caracteristicas de vertebrado como as células migratorias da crista neural, um endoesqueleto, um cérebro regionalizado e orgãos sensorias pares. Por apresentar um genoma não duplicado, uma copia unica para a maioria das familias multigenicas dos vertebrados, pelas suas caracteristicas morfologicas e do desenvolvimento transitorias aos vertebrados, pela disponibilidade de ferramentas de manipulação génica e vantagens de manutenção em laboratorio e do genoma de Branchiostoma floridae estar completamente sequenciado, o anfioxo é considerado como sendo um bom organismo modelo para estudar a transição de invertebrado a vertebrado. Em 1987, o primeiro receptor de efrina foi clonado. Os receptors (Eph) e ligandos (efn) de efrinas formam a maior das 14 subfamilias de receptores do tipo tirosina kinase. Estas possuem um dominio extracellular N-terminal que permite a interacção com o ligando; um dominio intracelular com funçao de kinase; um dominio SAM; e um dominio PDZ (Fig.4). Os ligandos estão subdivididos em dois grupos, as efnA que se encontram ancoradas à membrana via GPI (glycosylphosphatidylinositol) e as efn B que estão ancoradas por um dominio transmembranar (Fig.4). Os receptores EphA interagem preferencialemente com as efnA e as EphB com as efnB. Esta interacção ligando-receptor tem um papel crucial em processos celulares como a adesão, comunicação, rearranjos de citoesqueleto, divisão, migração, a activação de vias de sinalização citoplasmaticas que promovem a expressão génica. Deste modo, estão implicados em processos de desenvolvimento como a 5 migração das células da crista neural, segmentação e somitogénese, formação de sinapses e proriedades promotoras de tumores. Os receptores e ligandos de efrinas estão presents em todos os Metazoa (de esponjas a vertebrados) em numero (tab. 1), padrões de expressão e funções distintas. Varias das funções desempenhadas pelas efrinas em vertebrados são também encontradas em invertebrados. Foi sugerido que as funções das efrinas teriam evoluido de desempenhar um papel mais simples em processos cellular, ainda mantido em grupos mais basais na filogenia, para papeis mais versateis e diversificados, como os observados em cordados. Neste projecto propusemos um estudo de Evo-Devo da familia de genes das efrinas, pelo seu importante papel no desenvolvimento e pela sua presença em todas as espécies de Metazoa estudadas até a data, usando como modelo experimental o anfioxo europeu, devido à sua posiçao filogenética e caracteristicas. Com o objecctivo de melhor compreender a historia evolutiva e as funções durante o desenvolvimento deste genes os principais passos desenvolvidos foram: i) anotar e descrever os receptores e ligandos de efrinas em Branchiostoma floridae; ii) clonar e sequênciar os genes de efrina na especie europeia Branchiostoma lanceolatum ; iii) elucidar a relação filogenética da familia génica das efrinas em genomas de Metazoa disponiveis (Tab.1) ; iv) determinar os padroes de expressão, em diversos estadios de desenvolvimento, em ambos ligandos e receptores de efrina em Branchiostoma lanceolatum por hibridação in situ. A relação filogenética dos receptores de efrinas esta descrita na Fig.9 desta dissertação e foi realizada com sequências de proteinas no programa Mega4. Nesta analise pode-se verificar que as Eph de vertebrados agrupam-se monofiléticamente juntas. Os genes de cefalocordados estão basais aos de vertebrados, agrupando-se com os dos não-cordados. As Eph de urocordados formam um grupo polifilético, sugerindo a ocorrência de duplicações independentes nesta linhagem, estando CiEphE, CiEphD e CiEphG mais proximos dos vertebrados. Os receptores de efrina dos Cefalocordados parecem ter divergido mais cedo do que os receptores de efrina de urocordados CiEphE, CiEphD and CiEphG, estando de acordo com a topologia proposta por Delsuc (2006) para o Filo Chordata. Os genes de Nematostella vectensis agrupam-se com o outgrupo Ephydatia fluviatilis, sugerindo que esta especie esteve sujeita a duplicaçoes independentes. A topologia obtida para os ligandos de efrina esta representada na Fig.10. É de notar que os ligandos dos vertebrados formam dois grupos monofiléticos distintos, um que agrupa as efnA e outro as efnB. As efnA de vertebrados parecem estar filogenéticamente mais proximas das efnA de urocordados (CiefnAa, CiefnAb, CiefnAc and CiefnAd) e efnB mais proximas das efn de cefalocordados (Bfefn1, Bfefn2 e Bfefn3). Tal como observado com os receptors, os ligandos dos não-cordados formam um grupo monofilético. O estudo da expressão dos receptores (BlEph1 e BlEph2) e ligandos (Blefn1 e Blefn2) de efrina foi feita pela técnica de hibridação in situ em embriões de Branchiostoma lanceolatum durante varios estadios de desenvolvimento (morulas de 32 celulas até larvas de 60horas). No estadio de morula todos os genes expressam-se no embrião inteiro. 6 Durante a neurulação BlEph1 expressava-se na mesoderme lateral, nos somitos em formação e possivelmente no precursor da vesicular cerebral. Na neurula tardia encontrava-se expresso na notocorda e no tubo neural e na future região oral. No estadio de pré-boca expressava-se na notocorda anterior e posterior, na boca e faringe em formação. No estadio de larva este gene expressava-se na notocorda anterior e posterior, na vesicular cerebral, na boca, no endostélio, na glandula club-shaped, no diverticulum. (Fig.11) Durante a gastrulação, BlEph2 parecia expressar-se em todos os tecidos. Um padrão segmentado parecia aparecer durante a neurulação que parece seguir o padrão dos somitos em formação. No estadio de pré-boca BlEph2 expressava-se na boca em formação e na notocorda anterior. Nas larvas a expressão deste gene parecia localizar-se na boca e na região da faringe. (Fig.12) O padrão de expressão dos ligandos de efrina (Blefn1 e Blefn2) parecia estar de acordo com o padrão observado nos receptores. Em gastrulas Blefn1 expressava-se maioritariamente na mesoderme justo ao blastoporo. Durante a neurulação a expressão era mesodermica, junto ao fecho do tubo neural e também parecia expressar-se em populacões de neuronios. No estadio pré-boca parecia expressar-se na futura região oral, na notocorda posterior e a endoderme posterior. No estado de larva a expressão parecia mais restringida a zona da boca e da faringe, mas ligeiramente expresso nos restantes tecidos, exceptuando a vesicula cerebral. (Fig.13) Durante a gastrulação Blefn2 parecia expressar-se na gastrula inteira. Durante a neurulação a expressão parecia restringida a mesoendoderme, exceptuando o dominio mais posterior. Em embriões pré-boca parecia localizar-se na região da faringe em formação, na glandula de muco e na notocorda posterior. Em larvas a expressão parecia localizar-se na região da boca e da faringe e também na notocorda posterior (Fig.5F). Na literatura esta descrito que as efrinas expressam-se em cordados nas zonas dos somitos em formação, na notocorda, no tubo neural, na mesoderme paraxial e nos nervos perifericos, como demonstrado pelas imagens obtidas por hibridação in situ (Fig.11 a 14). Em vertebrados estes genes também participam na formação de varias estruturas faciais incluido a região oral e os seus padrões de inervação, padrão também observado nos receptores e ligandos de efrinas de Branchiostoma lanceolatum sugerindo a co-opção destes genes para esta função durante o desenvolvimento em Chordados (Fig.11-14). Com este trabalho foi possivel elucidar algumas das questoes sobre a expressão e a posição filogenética dos membros da familia genica das efrinas no anfioxo europeu (Branchiostoma lanceolatum). A estrutura destes genes parece ser conservada desde as esponjas aos vertebrados, mas também as funções desempenhadas durante no desenvolvimento. Entre estes incluem-seos processos a nivel cellular que, ao longo da evolução sofreram fenomenos de complexificação, na transição para cordados. Adicionado a estas observações, a topologia filogenética sugere fenomenos de co-opção para as novas funçoes de duplicações especificas de linhagem. Existem também evidências para convergência evolutiva entre espécies e de evolução paralela dentro da mesma espécie. Os cefalocordados parecem ocupar, relativamente a esta analise, uma posição entre os não-cordados e os vertebrados o que suporta a nova filogenia sugerida por Delsuc et al em 2006. No geral, pode-se sugerir que os genes da familia das efrinas diversificaram varias vezes ao longo da evolução dos 7 Metazoa e também que o ancestral dos urocordados e vertebrados apresentaria um unico receptor de efrina e dois ligandos. Contudo, dados adicionais sobre as funções, padrões de expressão génica e filogenia dos Metazoa seriam necessarios para melhor estabelecer uma relação evolutiva da familia génica das efrinas e o seu papel durante a evolução.
The Ephrin receptor and ligand gene families are implicated in several cellular processes such as cellular adhesion, communication, division, migration, and compartmentalization. These play an important role in development including, for instance, neural crest cell migration, somitogenesis, axon guidance, and have even been shown to have tumor promoting properties. They are described to be present from sponges to vertebrates in multiple copies, maintaining a conserved genomic structure. Cephalochordates, recently placed at the base of the Chordata, are considered to be the living animal that best approximates the ancestor at the transition from invertebrates to vertebrates. The phylogenetic analysis of this project shows that Eph and efn families have been independently expanded in amphioxus, vertebrate, and other Metazoan clades suggesting that each have convergently evolved complex Eph/efn complements. In the European amphioxus (Branchiostoma lanceolatum) the Eph/ephrin gene family seems to express mostly in the forming mouth apparatus, somites and notochord, as assessed by whole-mount in situ hybridization (ISH). The Eph/ephrin ISH expression pattern corresponds to some vertebrate characteristics for these genes, but they are also implied in several cellular processes similarly to invertebrates. In spite of the evidence, it is difficult to assess the exact evolutionary relationship and developmental role of these genes in amphioxus with these data, or to extrapolate to Metazoa.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010
URI: http://hdl.handle.net/10451/2390
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