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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/2463

Title: Looking at tricellulin expression in the brain
Authors: Mariano, Cibelle Neiva Cavalcanti, 1984-
Advisor: Caeiro, Filomena, 1950-
Brito, Maria Alexandra de Oliveira Silva Braga Pedreira de, 1960-
Keywords: Tricelulina
Expressão genética
Células neuronais
Teses de mestrado - 2010
Issue Date: 2010
Abstract: It was recently reported the existence of a protein, called tricellulin (TRIC), concentrated at tricellular tight junctions (TJ) but also present at bicellular contacts. Most of the studies have fallen upon epithelial tissues and, despite the similar ectodermic origin of nervous tissue, TRIC presence in brain cells has never been reported. Interestingly, TRIC mRNA expression was found in mature dendritic cells, raising the question of whether TRIC is present in the brain resident immunocompetent cells, microglia. Immunohistochemical, western blot and real-time PCR methodologies were used to investigate the expression of TRIC in the brain. TRIC expression was examined both in paraffin sections of human brain (hippocampus) and in human brain microvascular endothelial cells (HBMEC), either in primary culture (PC) or in a cell line (CL). We further investigated the TRIC expression in rat brain sections, in addition to PC of rat neurons and microglia. Immunofluorescence analysis of the CL revealed the presence of the protein in HBMEC and highlighted that it is concentrated at tricellular contacts, though distributed along bicellular contacts as well. Western-blot analysis of HBMEC showed a 64-kDa band corresponding to a protein of the predicted size for TRIC, and the presence of mRNA for TRIC was confirmed by real-time PCR. The presence of TRIC in brain endothelium was corroborated by immunohistochemical analysis of paraffin sections of human and rat brain. TRIC was also investigated in PC of rat neurons and microglia. TRIC mRNA was detected in neurons and microglia, although the protein was not detected by western blot. Most interesting is the clear immunofluorescence staining for TRIC in microglia cytoplasm. By revealing the presence of TRIC in HBMEC, as well as the protein occurrence in other than epithelial cells, this study shall have an important impact in the field of cerebral vascular biology and opens new avenues for future research, namely on the role of TRIC in nerve cells.
A barreira hemato-encefálica (BHE) é uma estrutura complexa e dinâmica que separa o sangue do encéfalo, e que possui um papel fundamental na manutenção da homeostase do sistema nervoso central (SNC). A BHE é constituída por uma monocamada de células endoteliais justapostas, que, juntamente com a membrana basal e as restantes células que compõem a unidade neurovascular (UNV), nomeadamente os pericitos, os astrócitos, os neurónios e a micróglia, conferem as propriedades bioquímicas, bem como a sua estrutura especializada. Nas células endoteliais encontram-se estruturas elaboradas, denominadas junções intercelulares de oclusão, que possuem um papel fundamental no controlo do efluxo e influxo de substâncias entre o SNC e a circulação sistémica. Estas junções intercelulares são compostas por proteínas de oclusão que promovem a adesão célula-a-célula, conferindo a característica semi-permeável da BHE. As junções de oclusão presentes no contacto entre duas células são designadas por junções bicelulares, e as junções que se encontram no contacto entre três células são denominadas de junções tricelulares. A Tricelulina (TRIC) é uma nova proteína de oclusão, identificada recentemente como pertencendo às junções de oclusão tricelulares, por se encontrar predominantemente concentrada nos contactos tricelulares, apesar de também estar presente nas junções bicelulares. Esta proteína pertence à família das proteínas transmembranares, como a ocludina, possuindo cerca de 32% de homologia com a mesma. A maioria dos estudos sobre a tricelulina têm sido desenvolvidos em células epiteliais, nunca tendo sido investigada em tecido nervoso, apesar da sua origem ectodérmica. Recentemente, foi identificada a expressão de mRNA da TRIC em células dendríticas diferenciadas, levando a questionar se a TRIC poderá também estar presente nas células imunocompetentes do cérebro, nomeadamente na micróglia. Assim, este trabalho de mestrado foi delineado com o objectivo de explorar se a TRIC está presente no endotélio microvascular do cérebro e investigar se a TRIC se encontra em células nervosas, descriminando os tipos celulares que a expressam. Para investigar a expressão da TRIC no cérebro foram utilizadas técnicas de imunohistoquímica, imunocitoquímica, western blot e PCR quantitativo em tempo real. A TRIC foi descrita como estando presente em vários tipos de células epiteliais, nomeadamente nas células da mucosa gástrica. Assim, iniciamos o nosso estudo em amostras de tecido gástrico, obtidas através de procedimentos cirúrgicos realizados no tratamento de patologias gástricas. A expressão da TRIC foi estudada em cortes histológicos de cérebro em parafina e em células endoteliais de capilares cerebrais humanos, quer em cultura primária, quer na linha celular utilizada no nosso laboratório. A expressão da proteína foi também investigada em cortes histológicos de cérebro de rato, bem como em culturas primárias de micróglia e neurónios de rato. A avaliação da presença da TRIC em cortes histológicos de estômago humano em parafina foi realizada através da técnica de imunohistoquímica. Os resultados obtidos demonstraram a expressão da proteína nas junções tricelulares e bicelulares das células epiteliais gástricas, assegurando assim que estavam estabelecidas as condições experimentais óptimas para a investigação da TRIC no cérebro. Os resultados da imunofluorescência nas células da linha celular endotelial monstraram a presença da proteína nas células endoteliais dos capilares cerebrais humanos e que a mesma é expressa nos contactos tricelulares, encontrando-se presente também nas junções bicelulares. Os ensaios de western blot evidenciaram uma banda de aproximadamente 64-kDa, correspondente à proteína TRIC. A expressão de mRNA foi também confirmada pela técnica de PCR quantitativo em tempo real. Os resultados de western blot e PCR obtidos para as células endoteliais da linha celular foram confirmados pelos das células da cultura primária, mas demonstram diferenças no nível da expressão, quer da proteína, quer do mRNA. Com esta técnica pareceu haver uma diminuição de expressão de aproximadamente 20-30% nas células endotelias da cultura primária, quando comparada com as células da linha celular. Este resultado pode ser justificado pela heterogeneidade das células, bem como das respectivas culturas. A presença de TRIC no endotélio dos capilares do cérebro foi corroborada através de estudos in situ feitos em cortes histológicos de rato, utilizando a técnica de imunohistoquímica. Interessantemente, os resultados evidenciaram também a expressão de TRIC nas junções tricelulares e bicelulares das células do plexo coroideu, o que seria esperado, uma vez que está descrita a presença de junções intercelulares nessas células que compõem a barreira sangue-líquido céfalo-raquidiano. Os resultados da técnica de imunofluorescência nos cortes histológicos de hipocampo humano estão de acordo com os resultados obtidos para rato. Efectivamente, os a análise in situ evidenciou a expressão da TRIC nas junções intercelulares das células endoteliais dos capilares cerebrais. Apesar de se saber que a BHE envolve diferentes tipos de células, até hoje não foi estudada a presença da TRIC nas células neuronais e não neuronais do cérebro. Assim sendo, no presente trabalho foi estudada também a presença da TRIC em outros tipos de células que não as endoteliais, mais especificamente nos neurónios e na micróglia. A expressão de mRNA foi evidenciada em todas as amostras, parecendo haver uma menor expressão nos neurónios e na micróglia, quando comparada com as células endoteliais da linha celular (aproximadamente 7% e 3%, respectivamente). De facto, a presença de proteínas de oclusão, como as claudinas e a ocludina, já foram reportadas em culturas primárias de neurónios e astrócitos. Para além disso, está descrita a presença das mesmas em cérebro humano, e sendo a TRIC uma proteína de oclusão da família da ocludina, a presença da mesma nos neurónios é um resultado provável. O mais interessante é o resultado da imunofluorescência na micróglia, que evidencia a expressão da proteína no citoplasma dessas células, sugerindo que a TRIC, de alguma forma, contribui para o sistema imune do cérebro. De facto, há estudos que descrevem a presença de TRIC, para além de outras proteínas de junção intercelular, em células dendríticas diferenciadas, as quais fazem parte do sistema imunitário. Existem ainda estudos que sugerem que as células imunocompetentes do cérebro, nomeadamente a micróglia, derivam da linhagem monocítica. Inesperadamente, não foi verificada a expressão da proteína nos neurónios. Uma possível explicação é o facto de não haver expressão proteica suficiente para que possa ser detectada por western blot e imunofluorescência. Por outro lado, duas outras hipóteses devem ser consideradas: haver expressão da proteína apenas em algumas circunstâncias, ou não haver, de todo, expressão proteica. De facto, há estudos que sugerem que a ocludina e a TRIC têm origem no mesmo gene, o qual duplicou ao longo da evolução filogenética, e tendo em conta também a presença de ocludina nos neurónios, é provável haver expressão de mRNA da TRIC nessas células. No entanto, é possível que haja expressão do mRNA sem necessariamente ocorrer a tradução do mesmo. Ainda assim, esta ausência de expressão poderá ser ultrapassada em situações pontuais, nomeadamente em patologias do SNC, em que ocorre sobre-expressão de proteínas de oclusão, como as claudinas e a ocludina. Reunindo estes dados com os resultados do presente estudo, talvez possamos especular que a função da TRIC esteja relacionada com a preservação da BHE. No entanto, são necessários mais estudos para completar os resultados obtidos. Concluindo, este estudo revela pela primeira vez a presença da TRIC no endotélio dos capilares cerebrais humanos, indicando que esta proteína faz parte das junções intercelulares, contribuindo assim para a função de barreira entre o sangue e o encéfalo. O presente estudo demonstra também pela primeira vez a presença da TRIC em células não epiteliais e abre novos caminhos para estudos futuros, nomeadamente qual o papel da TRIC nas células nervosas.
Description: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010
URI: http://hdl.handle.net/10451/2463
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