Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/24677
Título: Transcriptomic analysis of maritime pine response to infection with Bursaphelenchus Xylophilus, the causing agent of pine wilt disease
Autor: Gaspar, Daniel Filipe Branco
Orientador: Ramos, António Marcos Costa do Amaral
Pesquita, Cátia, 1980-
Palavras-chave: Bioinformática
Next-generation sequencing
RNA-sequencing
Pinus pinaster
Bursaphelenchus xylophilus
Doença da murchidão do pinheiro
Teses de mestrado - 2016
Data de Defesa: 2016
Resumo: A bioinformática é uma área mutidisciplinar que envolve a aplicação de técnicas computacionais para analisar informação biológica em larga escala. Este conjunto de ferramentas e técnicas computacionais foi desenvolvido para dar suporte à análise da crescente quantidade de dados gerados neste domínio, e em particular por técnicas de next-generation sequencing. Uma das áreas da biologia largamente dependente das ferramentas bioinformáticas é a análise do perfil do transcriptoma. Atualmente, a técnica de RNA-sequencing tem sido a abordagem predominante em estudos transcriptómicos de dados de sequenciação. Esta técnica tem sido bastante usada em estudos de resistência, especialmente em espécies florestais ameaçadas. A Floresta é um recurso natural essencial em termos globais, não apenas pela sua importância a nível ecológico, mas também a nível económico e paisagístico. Ela representa um suporte de Vida na Terra, fornecendo inúmeros benefícios fundamentais para o equilibrio de diversos ecossistemas. No entanto, recentemente tem vindo a verificar-se um preocupante declínio de várias espécies florestais, sendo o Pinheiro Bravo (Pinus pinaster Ait.) uma das mais afectadas. Este declínio tem causado um impacto negativo no equilibrio dos ecossistemas e na manutenção da biodiversidade. Um dos organismos com maior potencial destrutivo para a área florestal de Pinheiro Bravo é o nemátodo da madeira do pinheiro (Bursaphelenchus xylophilus), um verme microscópico responsável pela doença da murchidão do pinheiro. Numa tentativa de reduzir as perdas resultantes da doença, surgiram vários estudos de resistência do hospedeiro para a identificação de árvores com menor susceptibilidade à infecção. No entanto, parte desses estudos apresenta uma abordagem mais tradicional, sem recurso às novas tecnologias de sequenciação. Nesse sentido, o presente trabalho, baseado no estudo de dados de RNAsequencing produzidos pela plataforma de sequenciação Ion Proton, tem como principal objectivo a caracterização da resposta do Pinheiro Bravo à infecção com o nemátodo da madeira do pinheiro entre três diferentes estágios após inoculação. Para isso, foram identificados genes diferencialmente expressos, vias metabólicas e marcadores moleculares potencialmente associados à resistência à doença. Um total de 355,287 unigenes foram obtidos a partir de um conjunto de 176,282,168 reads sequenciadas para todas as bibliotecas, pela técnica de de novo assembly. A baixa percentagem de genes predictos (23.5%) a partir do conjunto de unigenes assemblados e o elevado número de genes sem anotação ou com anotação desconhecida, evidenciam as limitações existentes num estudo de RNA-Seq em espécies não-modelo, sem o genoma sequenciado, como é o caso do Pinheiro Bravo. Apesar disso, foram obtidos 17,533 genes diferencialmente expressos entre todas as comparações. No seguimento desta análise, há a evidência de duas fases de resposta à infecção. Em primeiro lugar, é desencadeada uma resposta imediata, logo após a infecção. Posteriormente, uma segunda fase de resposta parece acontecer aos 7 dias após a infecção. Foi ainda identificado um conjunto de genes candidatos envolvidos na resistência à doença nos vários estágios em estudo. Desse conjunto, é possível identificar genes envolvidos no metabolismo secundário, stress oxidativo e defesa contra infeção de agentes patogénicos. Este estudo representa uma nova abordagem ao nivel dos mecanismos moleculares e vias metabólicas envolvidas na defesa contra a infeção do nemátodo da madeira do pinheiro. Podendo assim ser um recurso útil para estudos ulteriores e também para programas de melhoramento com vista à seleção de plantas com menos susceptibilidade à doença.
Bioinformatics is a multidisciplinary field that involves the application of computational tools to analyze biological information on a large-scale. This set of computational techniques were developed to support the analysis of the increasing amount of data generated in this area, and in particular by next-generation sequencing (NGS). One of the main fields of biology that is largely dependent on bioinformatics tools is the transcriptome profile analysis. Currently, RNA-Sequencing (RNA-Seq) is the dominant transcriptomics approach for NGS data. RNA-Seq has been highly used in disease pathogenesis studies, especially in endangered forest species. Forests are essential resources on a global scale, not only for the ecological benefits, but also for economical and landscape purposes. They represent one of the Life support systems on Earth, providing essential resources for a range of ecosystems. However, in recent years there has been a worrying decline of a large number of forest species around the world, with maritime pine (Pinus pinaster Ait.) being one of the most affected. This alarming decay is caused by abiotic and biotic factors. Within this last group of factors we must highlight the pine wood nematode (PWN), Bursaphelenchus xylophilus as one of the main responsible. PWN is a microscopic organism reported for the first time in Portugal in 1999, being the causal agent of pine wilt disease (PWD). In an attempt to reduce losses arising by PWD, the study of maritime pine resistance is one of the research programs that recently started in Portugal, aiming to improve their resistance and select trees with lower susceptibility to infection. However, just a few of these studies were based on next generation sequencing data. Taking this into account, this study is an approach to pine wilt disease, using RNA-Sequencing data produced by Ion Proton platform. The aims of this study was to analyze RNA-Seq data to characterize the maritime pine transcriptome in the response to infection with Bursaphelenchus xylophilus, over three different time stages after inoculation of the PWN, by determining the differentially expressed genes, regulatory networks and pathways, with the purpose of identifying potential genes involved in resistance against PWD. A total of 355,287 unigenes were obtained by de novo assembly from the 176,282,168 sequenced reads for all libraries. Moreover, we obtained 17,533 differentially expressed genes (up and down regulated) between all comparatives. The low rate of predicted genes (23.5%) from the set of assembled contigs and the high number of genes without annotation or with "Unknown" annotation, evidences the existing limitations when working in RNA-Seq studies with non-model species like Pinus pinaster. Despite this, further analysis suggest an early response that may occur immediately after inoculation and a late response that may occur 7 days after inoculation. A set of candidate genes involved in resistance against PWN infection were identified over different time points. These genes were related to secondary metabolism, oxidative stress and defense against pathogen infection. Our results provide new insights about the molecular mechanism and metabolic pathways involved in resistance of Pinus pinaster against PWN infection. It may be a useful resource in future studies and for future breeding programs to select plants with lower susceptibility to PWD.
Descrição: Tese de mestrado, Bioinformática e Biologia Computacional (Bioinformática), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2016
URI: http://hdl.handle.net/10451/24677
Designação: Mestrado em Bioinformática e Biologia Computacional (Bioinformática)
Aparece nas colecções:FC-DI - Master Thesis (dissertation)

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