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Título: Estudo dos determinantes ambientais e genéticos que promovem o crescimento de bactérias do complex Mycobacterium tuberculosis em biofilme: o papel dos genes pks1 e pks15
Autor: Prata, Ana Sofia Lopes
Orientador: Cunha, Mónica Vieira
Palavras-chave: Complexo Mycobacterium tuberculosis
Biofilmes
pks 1
pks 15
Glicolípidos fenólicos
Teses de mestrado - 2016
Data de Defesa: 2016
Resumo: A tuberculose é uma doença infeciosa de etiologia bacteriana, considerada uma das doenças infeciosas com maior impacto na população humana: em 2014, foi diagnosticada em 9,6 milhões de pessoas, tendo provocado a morte a 1,5 milhões. Os dados epidemiológicos apontam ainda para que cerca de um terço da população mundial esteja colonizada com o agente etiológico, Mycobacterium tuberculosis, num quadro paradigmático de tuberculose latente, que ao reativar, despoleta uma infeção ativa com exacerbação de lesões e disseminação do microrganismo. Outro dos grandes focos de preocupação para as autoridades de saúde pública é a emergência e resistência deste agente aos agentes antimicrobianos utilizados no tratamento. Estima-se que, em 2014, 480.000 pessoas terão desenvolvido TB multirresistente (MDR-TB), dos quais 9,7% dos casos terão sido classificados como extremamente resistentes (XDR-TB). O género Mycobacterium inclui atualmente mais de 170 espécies distintas e pode ser dividido em dois grandes grupos: micobactérias de crescimento lento, como os agentes etiológicos da tuberculose bovina e humana, respetivamente Mycobacterium bovis (M. bovis) e Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis); e micobactérias de crescimento rápido, como Mycobacterium smegmatis (M. smegmatis). As micobactérias de crescimento lento são geralmente associadas a uma patogenia complexa, influenciada por múltiplos fatores, entre eles o seu genótipo e o do hospedeiro, e por fatores ambientais, exemplificadas pelos casos de tuberculose causada pelos agentes etiológicos da tuberculose humana e animal, que se inserem no designado complexo Mycobacterium tuberculosis (MTC). A abundância de ácidos micólicos e lípidos na parede celular é uma característica das espécies do género Mycobacterium, que apresentam uma superfície de consistência serosa e hidrofóbica. Num número limitado de espécies, na sua maioria patogénicas para o Homem, entre os lípidos expostos na superfície da parede celular encontram-se glicolípidos fenólicos (PGL) e dimicocerosatos de ftiocerol (DIMs). A maioria dos genes necessários à sua biossíntese estão localizados no locus DIM+PGL, e incluem os genes fadD26, ppsA-E, fadD28, pks15, pks1 e fadD29. A proteína a sintetase de poliquétidos Pks15-1 é crucial na produção de PGL, uma vez que na sua ausência não existe produção de PGL, com consequências associadas ao nível de: (i) impermeabilidade da parede celular; (ii) interferência com o processo de fagocitose; (iii) mecanismos de defesa contra stresses oxidativo e nitrosativo; e, teoriza-se, à capacidade de formar comunidades de células organizadas no interior de uma estrutura rica em ácidos micólicos e lípidos. Os atuais modelos de persistência micobacteriana descrevem a existência de populações de células latentes, que podem ser reativadas perante um quadro de imunossupressão por parte do hospedeiro. O fenótipo descrito para casos clínicos de tuberculose partilha similaridades com características exibidas por comunidades em biofilmes bacterianos, nomeadamente: elevada percentagem de células persistentes, elevada resistência a compostos antimicrobianos, e provável variação fenotípica de uma subpopulação heterogénea de células. Já foi demonstrada in vitro a capacidade de M. tuberculosis formar películas reticuladas na interface líquido-ar. Contudo, desconhece-se a capacidade deste agente e de outras espécies, como M. bovis, de formar estas estruturas in vivo. No entanto, já foi avançada a hipótese de que M. tuberculosis é capaz de formar comunidades organizadas em biofilme ao abrigar células tolerantes a drogas no interior de uma estrutura rica em ácidos micólicos livres, necessitando de um ambiente e programa genético específicos. Os estudos experimentais focados neste aspeto da fisiologia micobacteriana são ainda muito escassos, em parte pelas dificuldades associadas ao estudo destes microrganismos, quer pelas características fisiológicas inerentes e crescimento fastidioso, quer pela ameaça biológica que representam, nomeadamente em termos de saúde do operador e de outros membros do laboratório, sendo necessário o manuseamento das culturas bacterianas em laboratórios de biossegurança de nível 3 (BSL-3). Neste trabalho, colocou-se a hipótese de que a exposição de micobactérias a limitações de oxigénio e aos stresses nitrosativo e oxidativo presentes nos granulomas durante o processo de infeção poderia desencadear uma resposta de crescimento em biofilme e quais seriam as potenciais consequências dessa exposição sobre a produção de PGL. Pretendeu-se assim, em primeiro lugar, explorar abordagens de genómica comparativa para compreender a microdiversidade de alvos biológicos selecionados com base no seu potencial envolvimento no processo de formação de biofilmes e, subjacentemente, caracterizar a sua funcionalidade fisiológica aparente; estabelecer as condições ambientais que promovem a formação de biofilmes in vitro por micobactérias patogénicas; caracterizar o efeito exercido por essas condições na fisiologia e metabolismo micobacterianos, bem como na composição de lípidos da parede celular; explorar o perfil transcricional em condições selecionadas para investigar a base molecular do crescimento em biofilmes, iniciando-se também a construção de um mutante de eliminação com o objetivo de inferir acerca da função in vivo do gene alvo e a possível associação a formação de biofilmes. Da caracterização dos genes pks1 e pks15 que codificam Pks15-1, verificou-se, por pesquisa de homologia nas bases de dados, que as subunidades correspondentes aos seus produtos podem estar associadas a duas grelhas de leitura aberta (ORF), ou apenas a uma, dependendo da estirpe, sendo ainda sugerida a presença de seis domínios funcionais: KS (cetoacilsintetase), formado a partir do transcrito do gene pks15; AT (acilotransferase), DH (desidratase) ER (enoilredutase), KR (cetoredutase) e ACP (proteína transportadora de grupos acilo), formados a partir do transcrito do gene pks1. Da análise comparativa de 142 genomas de M. tuberculosis e M. bovis recolhidos das bases de dados internacionais, verificou-se que, de entre os vários domínios dos genes pks1 e pks15, KR apresenta maior acumulação de polimorfismos, sendo, por outro lado, KS o domínio com alterações mais frequente na maioria das estirpes estudadas. A região intergénica entre pks15 e pks1 regista vários polimorfismos que podem provocar a disrupção da grelha de leitura e impedir a transcrição de pks1 em alguns isolados, sugerindo transcrição diferencial destas duas ORFs nos isolados clínicos em circulação. A história microevolutiva de ambos os genes parece também ser diferente nos isolados de M. bovis e M. tuberculosis em estudo, verificando-se maior conservação das sequências nucleotídicas e aminoacídicas em M. bovis, enquanto cerca de metade das sequências nucleotídicas de M. tuberculosis analisadas apresentam elevado número de polimorfismos, resultante da acumulação de polimorfismos de nucleótido único (SNPs), inserções e eliminações. Alguns dos polimorfismos detetados resultam em substituições aminoacídicas semi- ou não-conservativas, conduzindo, por vezes, à alteração da grelha de leitura, com a produção de um codão STOP prematuro que impede a produção do transcrito completo do gene pks1 e leva à produção de uma proteína truncada, com ausência de vários dos presumíveis domínios estruturais. A análise da resposta fisiológica de micobactérias selecionadas (M. smegmatis mc2 155, M. bovis BCG Tokyo, e quatro estirpes de campo de M. bovis (I, II, III, IV)) perante diferentes condições ambientais que mimetizam o ambiente no hospedeiro, tais como: stresse oxidativo, induzido por peróxido de hidrogénio (H2O2), ácido ascórbico e metil de viologénio (MV); stresse nitrosativo, gerado por nitrito de sódio (NaNO2); e a presença de colesterol, permitiu concluir que, numa concentração de 25 mM, NaNO2 provoca inibição da formação de biofilmes e uma diminuição média da taxa de sobrevivência na ordem dos 50%. Relativamente aos compostos que causam stresse oxidativo, destaca-se sobretudo o efeito contrastante provocado pela presença de ácido ascórbico no crescimento e formação de biofilmes de M. smegmatis, M. bovis BCG Tokyo e M. bovis II, assim como a ação conjunta exercida por ácido ascórbico com metil de viologénio, que potencia a taxa de crescimento e promove a formação de biofilmes para valores largamente superiores aos obtidos durante o crescimento em condições controlo, o que sugere que a formação de biofilmes poderá ser desencadeada como resposta ao stresse. A análise da associação entre a formação de biofilmes por micobactérias patogénicas selecionadas, crescidas sob diferentes condições ambientais, e o perfil dos lípidos membranares produzidos nessas condições, com especial enfoque para o PGL, aferido por cromatografia em camada fina, também permitiu verificar que a estrutura química e quantidade relativa dos lípidos celulares formados varia com o tipo de stresse imposto. Relativamente à análise transcricional dos genes pks1 e pks15, cuja expressão relativa foi quantificada em condições de stresse por recurso a RT-qPCR, verificou-se que esta se encontra aumentada, quer na presença de stresse nitrosativo, quer oxidativo, mais evidente na presença de metil de viologénio (2,69 vezes em pks15 e 4,37 vezes em pks1) e de ácido ascórbico (1,40 vezes em pks15 e 1,63 vezes em pks1). A construção de um mutante de eliminação do gene pks1 por uma estratégia de transdução especializada, com vista a analisar e avaliar o papel do gene pks1 na fisiologia de micobactérias e comparar o efeito direto da presença/ausência deste na resposta a diferentes condições ambientais e na formação de biofilmes não foi concluída até ao final do presente trabalho, tendo-se no entanto completado a construção de um substrato de troca alélica (AES) para o fim pretendido. Os resultados obtidos no âmbito da presente dissertação permitem inferir uma história evolutiva contrastante para os genes pks15 e pks1 entre os dois ecótipos do MTC, com estirpes clinicamente relevantes e atualmente em circulação a apresentarem várias alterações disruptivas da grelha de leitura. Considera-se, assim, a possibilidade de um cenário de pseudogenização destas ORFs em estirpes de M. tuberculosis, não se descartando no entanto a possibilidade dos produtos destes genes exercerem uma atividade regulatória e/ou uma função biológica importante in vivo. Considerando os perfis fisiológicos e transcricionais obtidos e exibidos pelas micobactérias estudadas neste trabalho quando expostas a condições hostis à homeostasia bacteriana, reforça-se a possibilidade das micobactérias adotarem uma resposta fisiológica de formação de biofilmes como resposta ao stresse e de a sintetase de poliquétidos pks15-1 estar associada a processos biológicos relacionados com a produção e maturação de estruturas características de biofilmes, estando simultaneamente sujeita a pressão evolutiva purificante. As evidências reunidas neste trabalho poderão futuramente auxiliar ao desenvolvimento de estudos experimentais focados nos aspetos da latência e persistência da infeção das bactérias do MTC nos respetivos hospedeiros.
Tuberculosis (TB) is an infectious disease of bacterial aetiology with relevant socioeconomic aspects, considering the great impact upon the human population: solely in 2014, 9,6 million new TB cases were reported worldwide with 1,5 million of TB-related deaths. It has also been suggested that about one third of the world population is asymptomatically colonized with the aetiological agent, Mycobacterium tuberculosis. This latent colonization is considered a TB hallmark, which, in cases of immune downfall triggers an active infection with exacerbating lesions and dissemination of the bacilli. Special attention is also given to TB due to the recent increase in the number of antibiotic-resistant TB cases seen upon treatment. It is estimated that, in 2014, nearly 480.000 people developed multidrug-resistant TB (MDR-TB), of which 9,7% were classified as extensively drug-resistant (XDR-TB). The Mycobacterium genus includes more than 170 different species and may be divided into two large groups: slow-growing mycobacteria, such as the aetiological agents of cattle and human TB, Mycobacterium bovis (M. bovis) and Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) respectively, and fast-growing mycobacteria, such as Mycobacterium smegmatis (M. smegmatis). Slow-growing tuberculous mycobacteria are usually associated with a complex pathogenesis influenced by multiple factors, including genomic traits of both aetiological agent and host, combined with environmental factors, exemplified by cases of TB caused by human and cattle agents, which are grouped in the Mycobacterium tuberculosis Complex (MTC). The abundance of cell wall lipids and mycolic acids is characteristic of species of this genus, which exhibit a hydrophobic surface with a serous consistency. In a limited number of species, mostly pathogenic to man, among exposed lipids on the cell wall, we find phenolic glycolipids (PGLs). Most of the genes necessary for PGL biosynthesis are located at the DIM + PGL locus, and include fadD26, PPSA-E, fadD28, pks15, pks1, and fadD29. The pks15-1 product is crucial for PGL production, since in its absence there is no PGL production, with associated consequences in: (i) cell wall impermeability; (ii) interference with the phagocytosis process; (iii) defense mechanisms of the agent against oxidative and nitrosative stresses encountered upon entry into the human/host body; and the (still theorized) ability to construct organized communities of cells within a rich secreted layer of lipids and mycolic acids. Current models of mycobacterial persistence describe the existence of latent cell populations, which may reactivate upon host immunosuppression. The described phenotype of clinical TB cases shares similar characteristics with bacterial biofilm communities, namely: high proportion of persisting cells, augmented resistance to antimicrobial agents, and probable phenotypic variation of a heterogeneous subpopulation of cells. It has been shown that in vitro cultures of M. tuberculosis can assemble biofilm structures at the liquid-air interface. However, it is still unknown whether this species and others (such as M. bovis), have the ability to form these structures in vivo. Nevertheless, it has been hypothesized that, when deployed by specific environment and genetic programs, M. tuberculosis is able to form organized communities exhibiting drug tolerance within a structure that is rich in free mycolic acids. Experimental studies focused on biofilm assembly and mycobacterial physiology are still sparse, in part due to difficulties associated with the study of mycobacteria, with stringent physiological demands, slow growth and because of the biological threat they pose, particularly in terms of the operator’s and other lab members’ health; as such, experimental work with strictly pathogenic mycobacteria must be performed in a level 3 biosafety laboratory (BSL-3). In the current dissertation, we placed the possibility that exposure of mycobacterial cells to stresses found inside the host, such as nitrosative and oxidative stress, which are present in TB granulomas, may trigger a biofilm-type response and also affect PGL production. In a first stage, the comparative genomics of selected biological targets were explored, considering their apparent involvement potential in biofilm assembly and, subsequently, their apparent physiological function was characterized; later on, the environmental conditions that promote in vitro biofilm formation by pathogenic mycobacteria were established; the physiological and metabolic responses of selected mycobacteria, as well as lipid composition of the cell wall, were characterized in these conditions. The next steps included the characterization of the transcriptional profile of selected genes from cells grown in specific conditions to investigate the molecular basis of biofilms, and the construction of a knock-out mutant strain for a selected target gene, in order to infer its in vivo function and possible association with biofilm assembly. However, this last part was not fully completed during the current dissertation. The pks1 and pks15 genes, corresponding to one or two possible Open Reading Frames (ORF) depending on the strain, code for the polyketide synthetase Pks15-1 which possesses six functional domains: KS (ketoacylsynthase), formed from pks15; AT (acyltransferase), DH (dehydratase) ER (enoylreductase), KR (ketoreductase) and ACP (acyl carrier protein), formed from pks1. Comparative analysis of 142 M. tuberculosis and M. bovis genomes collected from Genbank evidenced the accumulation of polymorphisms at the various domains of pks1 and pks15 genes, with a greater accumulation of genomic variation within the KR domain, while KS domain exhibited variations that were more frequently shared among studied strains. The intergenic region between pks15 and pks1 presents several polymorphisms that may lead to disruption of the reading frame and prevent transcription of pks1, suggesting differential transcription of these two ORFs in clinical isolates that are currently in circulation. The microevolutionary history of both genes seems to be different considering M. bovis and M. tuberculosis, depicting greater genomic and aminoacyl conservation in M. bovis strains, while approximately half of the nucleotide sequences of the analyzed M. tuberculosis strains show high number of polymorphisms, due to accumulation of Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs), insertions and deletions. Some of the detected variations result in semi- or non-conservative aminoacyl substitutions, which could lead to frameshifts and/or formation of premature STOP codons, thus preventing assembly of a full pks1 transcript and leading to a truncated protein with absence of several presumed structural domains. Analysis of the physiological responses of selected mycobacteria (M. smegmatis mc2 155, M. bovis BCG Tokyo and four M. bovis field strains (I, II, III, IV) against diferente environmental conditions mimicking host environment, such as (i) oxidative stress, induced by hydrogen peroxide (H2O2), ascorbic acid or methyl viologen; (ii) nitrosative stress caused by sodium nitrite (NaNO2); (iii) and cholesterol presence, led us to conclude that, at 25 mM, NaNO2 causes inhibition of biofilm formation and a mean decrease of survival rate to approximately 50%. In regard to compounds causing oxidative stress, there was a remarkable contrasting effect caused by ascorbic acid on growth characteristics and parameters and on biofilm formation by M. smegmatis, M. bovis BCG Tokyo and M. bovis II, as well as the one caused by joint action of ascorbic acid with methyl viologen, which enhances the growth rate and promotes biofilm formation to substantially higher values than in control conditions, therefore suggesting that biofilm formation may be triggered by the bacterial population to cope with imposed stress. Association between biofilm formation of selected pathogenic mycobacteria grown under different environmental conditions, along with the profile of membrane lipids (with particular focus on the PGL) assessed by thin layer chromatography, evidenced that the chemical structure and the relative amount of cellular mycolipids varies with imposed stress. Regarding the transcriptional analysis of pks1 and pks15, whose relative expression in cells grown under stress conditions was quantified by RT-qPCR , results show several fold increase under nitrosative and oxidative stress, namely in the presence of methyl viologen (2,69 times in pks15 and 4,37 times in pks1) and ascorbic acid (1,40 times in pks15 and 1,63 times in pks1). The construction of a pks1 deletion mutant by specialized transduction was initiated in order to analyse and evaluate the direct role of pks1 in mycobacteria physiology and to compare the effect of its presence/absence in response to several environmental conditions and biofilm assembly. This part of the work was not fully concluded in the present dissertation. However, assembly of the allelic exchange substrate (AES) was successfully completed. The results obtained in the present study allow us to infer a contrasting evolutionary story for pks15-1 between the two ecotypes of MTC, with clinically relevant strains that are currently in circulation showing accumulation of several disrupting genomic variations, potentially leading to a non-functional protein. It is therefore hypothesized the possibility for a pseudogenization scenario in M. tuberculosis strains, yet we cannot discard the possibility for these gene products to exert a relevant in vivo function in the mycobacteria infection pathway. All results considered, the possibility of mycobacteria adopting a biofilm-like response to cope with deleterious conditions is reinforced, as well as the association of pks15-1 to the biological processes related to the production and maturation of biofilm-characteristic structures. Subsequent studies build on these trends may shed light into the latency and persistence phenotypes of TB , which are key hallmarks of this socioeconomically-relevant infection.
Descrição: Tese de mestrado em Microbiologia Aplicada, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2016
URI: http://hdl.handle.net/10451/24870
Designação: Mestrado em Microbiologia Aplicada
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