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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/2577

Title: Characterization of post-trancriptional control mechanisms regulating SMN2 gene expression
Authors: Gomes, Ana Luísa Rodrigues, 1987-
Advisor: Carvalho, Margarida Henriques da Gama, 1972-
Telhada, Maria Margarida Blasques, 1951-
Keywords: Biologia molecular
Expressão génica
Atrofia muscular
Teses de mestrado - 2010
Issue Date: 2010
Abstract: Research has demonstrated that a significant part of gene expression control is taking place at the post-transcriptional level, determining the stability and translation efficiency of mRNA molecules. These regulatory switches are under the control of RNA-binding proteins and microRNAs that associate predominantly with the 5’ and 3’ UTRs. The prospect for development of effective therapies for Spinal Muscular Atrophy is enhanced by the existence of an almost identical copy of the SMN1 gene-mutated in SMA. The SMN2 gene can produce the functional protein at low levels; however variations in its copy number and thus, protein expression output have been shown to modulate disease severity in affected individuals. Although it is clear that the control of mRNA translation and stability can influence dramatically the protein output of a given gene, and in spite of the advantages that increased SMN2 expression may provide to patients, no systematic study has thus far been performed on the post-transcriptional control mechanisms acting on the SMN2 mRNA. Therefore, the identification of these mechanisms is of great interest, as it may provide the basis for new therapies for SMA. To identify and characterize the SMN2 post-transcriptional mechanisms regulating the SMN2 mRNA we established a Luciferase reporter system for monitoring UTR-dependent regulatory events. We verified that the SMN2 3’UTR region has a regulatory role in the mRNA stability, which results from a balance of positive and negative cis-acting elements. We also identified key conserved nucleotides in the 3’UTR, whose mutation resulted in increased mRNA expression levels. Analysis of the SMN2 5’UTR region indicates that this region has a negative regulatory effect on the SMN2 expression due to presence of a uORF. We additionally performed systematic validation of novel predicted alternative SMN2 5’ and 3’UTR sequences. We were able to validate the expression of an alternative 5’UTR isoform and obtained preliminary evidence for the regulation of SMN transcripts by the Nonsense Mediated Decay pathway.
A quantidade de proteína produzida a partir de determinado gene resulta de um complexo balanço entre mecanismos de síntese, de modificação e de degradação. Estes mecanismos actuam em diversos níveis de regulação da expressão génica. Ao longo dos últimos anos de investigação tem-se tornado cada vez mais claro que todos os níveis envolvidos nesta regulação, desde a transcrição, processamento da molécula pré-mRNA, degradação do RNA mensageiro (mRNA), tradução, até à estabilidade da proteína, estão sujeitos a um apertado controlo, todos eles podendo ter um impacto comparável nos níveis finais de proteína. Apesar de o controlo ao nível da transcrição ser visto como o principal nível de regulação, tem-se verificado, no entanto, que a regulação pós-transcricional tem uma profunda influência nos níveis de síntese de proteína, em particular através de mecanismos que regulam a estabilidade da molécula de mRNA e a eficiência de tradução da mesma. Envolvidos nestes mecanismos estão vários factores que são designados como efectores que, consoante os sinais celulares, actuam positiva ou negativamente na expressão de um gene. Há já algum tempo que se identificou a família das proteínas de ligação ao RNA (RNA Binding Proteins ou RBPs) como principal efectora do controlo pós-transcricional. Estas proteínas reguladoras normalmente ligam-se a sequências degeneradas, geralmente localizadas nas regiões não traduzidas (UTR) a 5’ e 3’ da molécula de mRNA, que funcionam como plataformas para a interacção da molécula de mRNA com a maquinaria de degradação ou de tradução. Recentemente foram identificadas pequenas moléculas de RNA não codificantes, microRNAs, que também actuam como efectores dos mecanismos de regulação ao nível do controlo pós-transcricional. Vários anos de pesquisa permitiram reunir evidências que demonstram que uma parte significativa do controlo da expressão génica ocorre a nível pós-transcricional. A compreensão deste nível de regulação será uma ferramenta poderosa no esclarecimento da complexidade do controlo da expressão de determinado gene. Este esforço de investigação será não só importante para o conhecimento geral, mas particularmente crucial na investigação de doenças, onde a caracterização dos mecanismos regulatórios pode permitir a criação de métodos para a modulação terapêutica expressão da molécula envolvida na doença. A Atrofia Muscular Espinhal (SMA), uma das principais doenças hereditárias causadora de morte infantil, é uma doença neuromuscular causada pela perda de função do gene Survival of Motor Neuron 1 (SMN1). Tal como acontece noutras doenças hereditárias, grandes esforços têm sido desenvolvidos para a descoberta de uma terapia eficaz de forma a aliviar os sintomas nos pacientes. Em comparação com outras doenças causadas por perda de função de um gene, a desenvolvimento de terapias moleculares dirigidas tem sido, em parte, facilitada na doença SMA uma vez que um “alvo” principal foi já identificado. Estudos moleculares do gene envolvido na doença permitiram a identificação de uma segunda cópia, em quase tudo semelhante ao gene SMN1. Este gene SMN2 foi originado por uma duplicação invertida da porção terminal do cromossoma 5. Os genes SMN1 e SMN2 diferem em apenas 5 nucleótidos, sendo que a região codificante não é afectada. A grande diferença entre os dois genes é uma transição silenciosa no exão 7, de um C por um T, que induz a exclusão deste exão em 75% dos transcritos produzidos a partir do gene SMN2. Este evento resulta na produção de uma versão truncada da proteína SMN que não é funcional. Estudos efectuados apontam para que a SMA seja causada pela baixa quantidade de proteína completa e funcional, afectando principalmente as células neuronais motoras. Contudo já se verificou que há uma variabilidade natural na severidade dos sintomas, devido há presença de múltiplas cópias do gene SMN2, tendo-se verificado que quanto maior o número de cópias deste gene, maior é a compensação, nas células neuronais, da perda de função do gene principal. Estes estudos sugerem que um possível tratamento para alívio dos sintomas nos pacientes poderá passar pela indução de aumento da expressão do gene SMN2. Embora seja cada vez mais claro que o controlo da estabilidade e eficiência de tradução da molécula de mRNA tem um grande impacto na quantidade de proteína produzida e apesar das vantagens em aumentar a expressão do gene SMN2 nos pacientes, até ao momento, nenhum estudo sistemático foi realizado no sentido de caracterizar os mecanismos pós-transcricionais que actuam sobre o mRNA do SMN2. A identificação de motivos regulatórios que possam ser utilizados para a modulação da expressão do gene SMN2, ao nível de reguladores pós-transcricionais, poderá ser vista como uma ferramenta útil para o desenvolvimento de futuras abordagens terapêuticas. Por exemplo, a caracterização de elementos na sequência que induzem a desestabilização do mRNA do SMN2 pode permitir o desenho de pequenos oligonucleotidos específicos que bloqueiem a ligação de reguladores negativos e assim modular significativamente a quantidade de proteína SMN produzida. Para a caracterização dos efeitos regulatórios das regiões não traduzidas do mRNA (UTRs) do SMN2 procedeu-se à identificação de elementos na sequência que possam estar envolvidos na regulação pós-transcricional. Com este objectivo, procedeu-se ao estabelecimento de um modelo experimental para estudo de efeitos regulatórios mediados pelos UTRs, envolvendo a criação de um gene repórter em que se fundiu a sequência codificante da luciferase com as regiões 5’ e 3’UTR do SMN2. Quando testadas as diferentes construções do gene repórter com as regiões UTR verificou-se que estas têm um papel na regulação pós-transcricional do mRNA do SMN2, uma vez que a quantidade de proteína produzida por cada uma é diferente em relação à obtida a partir de um vector que apenas contém a sequência da luciferase. Em particular para o 3’UTR do gene SMN2, os resultados obtidos permitiram identificar três grandes regiões reguladoras, sendo que as extremidades têm um efeito negativo sobre a expressão do mRNA. Também se verificou que o controlo pós-transcricional promovido por esta região ocorre ao nível da regulação da estabilidade do mRNA, uma vez que para cada construção testada os níveis de mRNA são semelhantes aos de proteína. Através da análise bioinformática, identificou-se na região 3’UTR a presença de nucleótidos conservados, normalmente associados a motivos reguladores funcionais. A mutação pontual de alguns desses nucleotidos resultou em aumento dos níveis de expressão de luciferase acima dos 20%, o que pode ser explicado pela destruição de um motivo de ligação de um factor de regulação negativa ou de uma estrutura secundária desestabilizadora. Com a clonagem da região 5’UTR do gene SMN2 no sistema repórter verificou-se uma grande redução dos níveis de expressão de luciferase. Através da análise bioinformática identificou-se a presença de uma uORF, um elemento cis descrito como sendo uma barreira de regulação negativa na expressão de determinados genes. Quando perturbado o reconhecimento desta uORF pela maquinaria de tradução, através da mutação pontual do uATG, verificou-se um aumento da expressão de luciferase de 50% em relação ao UTR normal. Para além da análise dos UTRs do mRNA codificado pelo gene SMN2, tentámos proceder à validação experimental de isoformas alternativas destas sequências descritas em diversas bases de dados, uma vez que se sabe que contribuir para criar variabilidade nos mecanismos de regulação pós-transcricionais. Este estudo permitiu confirmar a existência de uma isoforma alternativa do 5’ UTR do gene SMN2, cuja função celular é desconhecida, e obter evidências preliminares para a existência de outras isoformas deste mRNA que são alvo de regulação pela via do “non-sense mediated decay”. Os resultados apresentados nesta tese permitiram demonstrar a existência de mecanismos de controlo pós-transcricional que regulam a expressão do mRNA do gene SMN2 através dos seus UTRs e ainda identificar algumas das sequências reguladoras envolvidas. Estes elementos identificados podem ser considerados como potenciais alvos terapêuticos para promover um aumento da produção da proteína SMN funcional nos pacientes SMA e assim aliviar a severidade da doença.
Description: Tese de mestrado. Biologia (Biologia molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010
URI: http://hdl.handle.net/10451/2577
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