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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/2578

Título: MicroRNA and gene expression profiling of adult cardiac stem cells
Autor: Pinheiro, Ana Isabel Ribeiro de Melo, 1987-
Orientador: Carvalho, Margarida Henriques da Gama, 1972-
Malhó, Rui, 1967-
Palavras-chave: Biologia molecular
Células estaminais cardíacas
MicroRNA
Doença cardíaca
Teses de mestrado - 2010
Issue Date: 2010
Resumo: In recent years stem cells and progenitor cells have been identified in the heart, changing the paradigm that the heart is a post mitotic organ. The paradigm shift that is emerging from these studies can change the understanding and therapeutic approach of heart diseases, opening new avenues in the field of cell therapy. Several genes have been identified as regulators of stem cell function and cardiomyocyte differentiation. More recently, microRNAs have been identified as master switches controlling proliferation and differentiation events and, in particular, to function as key regulators of cardiac development and response to stress. In this study, we proposed to identify novel regulators of stemness and differentiation of the stem cell population present in the adult heart, which may be used to manipulate cell fate in vivo. For this purpose we have used the mouse as a model organism to characterize microRNA and gene expression patterns from samples Sca1 positive heart stem cells, as well as samples from different populations including bone marrow (lineage negative) cells and embryonic heart cells (Embryonic Day 9) were determined. We were able to improve the initial methodologies of the study, establishing a microRNA profile from each cell population. Within the miR panel that was studied, a subset with relative high expression levels in heart stem cells was identified, which may act as negative regulators of differentiation and proliferation. Although the overall expression profile of Sca-1 positive cells is closer to bone marrow cells, the most highly expressed miRs in heart stem cells are distinctive and predicted to target key genes involved in the control of cell proliferation and adhesion, vascular function and cardiomyocyte differentiation. In the future, identified microRNAs will be subject of several functional studies, using modified oligonucleotides “antagomirs” to establish their role in the heart stem cell proliferation and differentiation. The results from this study offer new insights into the gene expression networks of these different cell populations and supporting the importance of this rising area in the field of cardiac development and disease.
Recentemente as células estaminais foram identificadas no coração sugerindo que este órgão não é pós-mitótico. Estas novas descobertas podem mudar o conhecimento e as abordagens terapêuticas para a patologia cardíaca, revelando novas perspectivas no campo da terapia celular. A origem destas células estaminais cardíacas está ainda por esclarecer e pouco se conhece acerca da expressão genica que regula a sua proliferação, diferenciação e renovação. Foi já estabelecido que as funções das células estaminais e a diferenciação de cardiomiócitos são reguladas por diferentes genes e em particular por microRNAs (miRs) têm surgido como os principais reguladores do destino celular e desenvolvimento, facilitando assim a identificação de fenótipos celulares específicos (Wang et al,2008). O objectivo principal desta tese, foi identificar novos reguladores de estaminalidade e diferenciação da população de células estaminais presentes no coração adulto que podem ser usados com o propósito de manipular o destino celular in vivo. As células estaminais embrionárias e as células estaminais adultas regulam a formação de tecidos e homeostasia do organismo, derivando do blastocisto e dando origem ao feto. Vários tipos de células são originados durante o processo tais como células progenitoras e células estaminais tecidulares que eventualmente darão origem a todas as células do organismo (Suh et al, 2004). Estas células são mantidas por um conjunto de factores de transcrição chave, que por sua vez são regulados pela expressão de microRNAs, tais como e Oct4, Sox2, Nanog, Klf-4,c-Myc, Tcf3 and Lin28. Existem evidências de diferentes miRNAs que são expressos em diferentes tipos/estadios celulares, que podem ser capazes de regular a diferenciação e auto regulação que são as principais características das células estaminais. Comparando os perfis de expressão de microRNAs das células da medula óssea com células estaminais cardíacas e coração embrionário esperamos conseguir perceber se estas células tiveram origem na medula óssea e migraram posteriormente para o coração ou se originaram no próprio coração formando nichos (Baerzi et al, 2007). Ao aceder a este tipo de informação esperamos não só perceber a proveniência destas células, mas também identificar os microRNAs responsáveis pela manutenção do estado celular assim como do seu destino. Para este estudo foram escolhidas populações e tecidos celulares: células estaminais cardíacas sca1 positivas, células da medula óssea de linhagem negativa e corações embrionários de ratinho (E=9). Estas populações foram já referenciadas como tendo a capacidade de se diferenciarem em células cardíacas e tendo uma actividade proliferativa muito elevada após estímulo como células de medula óssea e células estaminais cardíacas. No caso do coração embrionário optou-se pelo nono dia embrionário, não só porque neste estádio de desenvolvimento existem evidências da regionalização do coração, mas também porque que as células se encontram com elevada taxa de proliferação, sem estarem no entanto completamente diferenciadas. Este estádio apresenta também vantagens em termos técnicos, uma vez que nesta fase é consideravelmente fácil conseguir destacar o coração do embrião. Em primeiro lugar, foi necessário melhorar as técnicas de isolamento das populações celulares que já tinham sido estabelecidas para cultura celular. Foram então escolhidas as metodologias de isolamento e quantificação mais adequadas. Para preservar a qualidade do RNA extraído das amostras foi usado miRvanaTM miRNA Isolation Kit, sorteando-se em seguida as células por FACS (Fluorescent Activated Cell Sorting), quantificando-se finalmente as amostras após análise no Agilent 2100 bioanalyzer. Os microRNAs constituem marcadores ideais para caracterização molecular, uma vez que são menos susceptíveis a degradação e alterações quando comparados a amostras de mRNA (Doleshal et al, 2008). Diversas abordagens para a detecção e quantificação de microRNAs já estão a ser desenvolvidas, mas não podem ser realizadas em casos de quantidades reduzidas de RNA. Por esta razão, foram adoptadas metodologias de qRT-PCR para avaliar os níveis de expressão de microRNAs, tais como a utilização de sondas TaqMan microRNA (Applied BioSystems) e um “array” de microRNAs de células estaminais para qPCR (Systems Biosciences), sendo que ambos revelaram grande sensibilidade e robustez na detecção e quantificação de microRNAs em amostras de reduzida quantidade de RNA. Apesar das dificuldades, fomos capazes de melhorar significativamente as metodologias de isolamento celular e de RNA, e no final deste trabalho conseguimos obter amostras de células estaminais cardíacas Sca1 com sinais de amplificação em qPCR para o gene endógeno sno202, comparáveis às obtidas para 1ng de RNA em amostras de coração embrionário. Desta forma, fomos capazes de obter um perfil ainda que preliminar, de algumas amostras de células estaminais cardíacas. Apesar destes progressos, ainda estamos muito próximos do limite mínimo de detecção de Agilent Bioanalyser (500-5000pg/μl), e por isso ainda estamos longe de atingir os valores mínimos para realizar perfis de expressão em larga escala. A fim de estabelecer o perfil de microRNAs de cada população, usamos então um array especifico que incluía microRNAs com funções referenciadas na diferenciação de células estaminais, verificando que cada população possuía um perfil distinto de microRNAs. Para obter novas informações acerca das origens da população de células estaminais cardíacas, realizamos uma análise comparativa entre esta população e as restantes populações alvo neste estudo: células da medula óssea de linhagem negativa e células do coração embrionário. Foi então detectado um conjunto de microRNAs de elevada expressão na população de células estaminais cardíacas: miR-126; miR-125a; miR-125b, miR-23b and miR-23a. Estes microRNAs estão aparentemente envolvidos em diferentes processos de interesse, tendo como alvos vários genes que regulam as funções das células estaminais cardíacas. Para tentar perceber quais as funções celulares que estes microRNAs podem estar a regular, realizamos duas abordagens complementares de análise funcional para os microRNAs identificados nas células estaminais cardíacas. Desta forma, usamos a base de dados TargetScanTM, para identificar os alvos previstos dos microRNAs seleccionados. Esta lista de alvos foi então analisada no programa GoElite (versão 1.2.) para identificar os processos celulares e as vias em que estes poderiam estar incluídos. Esta análise revelou-se frutífera, uma vez que os microRNAs com grande expressão nas células estaminais cardíacas, estão aparentemente envolvidos em processos de regulação de factores de transcrição, desenvolvimento de vasos sanguíneos, diferenciação de células estaminais e crescimento de órgãos, nomeadamente miR-125a and miR-126. Outra abordagem utilizada, consistiu na utilização da base de dados GeneGo (MetaCore TM) para a identificação de alvos e reguladores já validados experimentalmente, dos microRNAs seleccionados, relacionando-os com redes de interacção relevantes para o controlo da proliferação e diferenciação de células cardíacas. Verificou-se que vários alvos dos microRNAs seleccionados estão envolvidos em diferentes processos cruciais para a função das células estaminais cardíacas. Em paralelo, foi também realizada uma análise de enriquecimento que apontou na mesma direcção das restantes análises, mostrando que os alvos e reguladores dos miRs seleccionados participam em diversos processos como diferenciação celular. Estas duas abordagens, apesar de terem bases distintas, actuam como complemento, servindo o mesmo propósito de obter novas informações acerca do papel dos microRNAs que caracterizam esta população de células estaminais cardíacas. Este estudo comparativo entre as três populações, revelou que apesar do perfil geral de células estaminais cardíacas Sca1 positivas ser mais próximo das células da medula óssea que pode dar algumas pistas acerca da sua origem, estas células revelam um perfil de microRNAs distinto. Este perfil parece ser uma mistura entre as duas populações de células da medula óssea e de coração embrionário, constituindo um perfil distinto de ambas as populações. Diversos microRNAs detectados na população de células de medula óssea e coração embrionário foram já referenciados em outros estudos. miR-133a foi detectado com elevada expressão em amostras de coração embrionário, vindo de encontro ao facto de estar altamente expresso no músculo cardíaco. Este microRNA está também associado à patologia cardíaca, uma vez que a sua reduzida expressão pode causar hipertrofia cardíaca (Ivey and Srivastava, 2010). Outra observação interessante consiste na presença de vários microRNAs, também em coração embrionário, que estão referenciados como constituintes do cluster mir 17-92. Este cluster está referenciado como estando envolvido em processos de desenvolvimento em cancro humano, como linfomas e cancro do pulmão (Ventura et al, 2008). Aumenta os níveis da proteína proapoptótica Bim, inibindo o desenvolvimento de células B (Doeble et al, 2010). Foi também referenciado que corações deficientes neste cluster apresentam defeitos septais, indicando o envolvimento deste cluster no desenvolvimento cardíaco (Ventura et al, 2008). O envolvimento deste cluster em diversos processos de interesse deste estudo, poderá indicar que os microRNAs detectados podem participar no desenvolvimento cardíaco e serem potenciais agentes terapêuticos no futuro. A fim de se obter informação importante acerca dos processos celulares e redes de interacção em que estes estão envolvidos, particularmente na correlação com os perfis de expressão de microRNAs, foi também importante caracterizar os perfis de expressão génica de cada população. Este tipo de informação permitir-nos-á entender melhor a proveniência e destino das populações celulares alvo deste estudo, assim como perceber como o seu fenótipo é regulado por estas pequenas moléculas. Como já foi referido, a quantidade de material disponível revelou-se muito limitada, sendo necessário recorrer a técnicas direccionadas de qPCR, a fim de se quantificar a expressão de genes que já estavam referenciados como sendo importantes em processos biológicos, como a manutenção da estaminalidade celular e a diferenciação em células cardíacas. Fomos capazes de estabelecer as condições necessárias para proceder ao estabelecimento de perfis de expressão dos genes chave envolvidos na diferenciação cardíaca, mas infelizmente não foi possível obter amostras com quantidades quantificáveis de RNA.Os resultados obtidos para a quantificação dos genes algo usando o gene endógeno GAPDH como normalizador, revelaram um aumento da qualidade das amostras de RNA isoladas da população de células estaminais cardíacas. Foi também realizada uma quantificação para Pitx2 e GAPDH, que revelou que as células estaminais cardíacas expressam Pitx2 ao nível de células do coração embrionário. Por esta razões, acreditamos que no futuro seremos capazes de aumentar a qualidade de RNA nas amostras e consequentemente estabelecer perfis de expressão para todos os genes alvo, procedendo assim a uma comparação efectiva entre as três populações em estudo. No futuro, será importante validar os resultados obtidos na expressão de miRs para amostras de populações celulares, num contexto de tecido preservado. Uma abordagem possível de detecção da expressão de microRNAs será a utilização de ensaios de hibridação “in situ”, recorrendo a técnicas de maior sensibilidade como o a utlização de LNAs (locked nucleic acid) (Obernosterer et al, 2007 and Silahtaroglu et al, 2007). Outros ensaios de manipulação funcional dos microRNAs podem ser também efectuados. Ao alterar a expressão génica através de antagonistas ou miméticos de mciroRNAs poderemos entender melhor o seu desempenho em processos de relevo e como agentes terapêuticos Estes ensaios constituem uma excelente oportunidade para revelar um pouco mais sobre os mecanismos de actuação dos microRNAs. Com este trabalho, fomos capazes de obter novas perspectivas sobre as populações celulares seleccionadas. Atendendo que a regulação de microRNAs se tem revelado de extrema importância ao nível do desenvolvimento e doença, nomeadamente a patologia cardíaca, esperamos que o identificarmos potenciais reguladores de estaminalidade e diferenciação desta população de células estaminais presentes no coração adulto, ter contribuído de forma significativa para um melhor conhecimento acerca deste assunto.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Celular e Biotecnologia). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010
URI: http://hdl.handle.net/10451/2578
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