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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/2588

Título: The role of fitness frequency-dependent in the evolution of antibiotic resistance
Autor: Alves, Diana Ribeiro, 1987-
Orientador: Dionísio, Francisco, 1971-
Ponce, Ana Rita de Heaton Ayres, 1972-
Palavras-chave: Microbiologia
Resistência aos antibióticos
Escherichia coli
Teses de mestrado - 2010
Issue Date: 2010
Resumo: Antibiotic resistance is, usually, associated with fitness costs for the bacteria. Therefore, it is expected that if one competes a resistant bacterial strain with an otherwise isogenic susceptible strain in an antibiotic free environment, resistant bacteria will be eliminated. Here, I report the occurrence of stabilizing frequency-dependent selection in 43% of a set of antibiotic resistant strains. Stabilizing frequency-dependent selection may promote the maintenance of a stable polymorphism between resistant and susceptible bacteria. If resistant bacteria are rare, their fitness is higher than that of the susceptible strain. If resistant bacteria are the majority in the competition assay, their fitness is smaller than that of the susceptible strain. This enables a stable coexistence between sensitive and resistant strains. Genetic and ecological causes of frequency-dependent selection were investigated. The demonstration of frequency-dependent selection involving drug resistance strains implies that antibiotic resistant bacteria will not be easily eliminated or reversed upon reduction of antibiotic use. This reveals a worrying scenario for the eradication of antibiotic resistance.
Durante muito tempo foi admitido que as populações bacterianas seriam mantidas num estado monomórfico devido a dois fenómenos: competição exclusiva e selecção periódica. O principio da exclusão competitiva refere que duas ou mais espécies que competem pelos mesmos recursos não podem coexistir, uma vez que a espécie mais eficiente irá eliminar gradualmente todas as outras (Hardin, 1960). O processo de selecção periódica, em que a evolução de populações bacterianas num recurso limitante consiste numa série temporal de substituições por genótipos cada vez com maior sucesso reprodutivo ou fitness, é responsável por eliminar toda a variabilidade genética (Atwood, et al., 1951, Levin, 1981). A existência de polimorfismos seria, então, apenas uma etapa transitória no processo evolutivo. Contudo, o processo de competição entre espécies é muito mais complexo. O ambiente dos organismos, biótico e físico, é heterogéneo espacial e temporalmente. Portanto, as frequências dos diferentes genótipos numa população estão continuamente a sofrer alterações. Ao mesmo tempo, existem mecanismos responsáveis pela manutenção de polimorfismos nas populações bacterianas. A selecção dependente da frequência é um desses mecanismos. A selecção dependente da frequência já foi observada em organismos como Drosophila (Ayala, 1971), Escherichia coli (Levin, 1972, Helling, et al., 1987) e em vírus (Elena, et al., 1997, Yuste, et al., 2002). Num sistema biológico, em que a selecção dependente da frequência actua, o sucesso reprodutivo de um organismo está dependente da sua frequência. Este mecanismo pode resultar em dois cenários diferentes. Assim sendo, a selecção pode favorecer o genótipo mais comum, definindo-se como selecção dependente da frequência disruptiva. Por outro lado, se a selecção favorecer o genótipo mais raro, então estamos perante selecção dependente da frequência estabilizante. A selecção dependente da frequência disruptiva leva à eliminação de polimorfismos na população. Um genótipo, mesmo possuindo uma qualquer vantagem, apenas será seleccionado face a outro genótipo se a sua frequência se encontrar acima de um certo valor (Levin, 1988). Caso contrário, o genótipo é eliminado. A selecção dependente da frequência estabilizante, sobre a qual nos iremos focar neste trabalho, resulta num ponto de equilíbrio que permite a coexistência estável entre os genótipos. Se a frequência de um dos genótipos está abaixo do equilíbrio estável, o seu fitness relativamente ao outro genótipo será maior, permitindo-lhe aumentar a sua frequência. Se a sua frequência estiver acima do ponto de equilíbrio, o seu fitness será menor do que o outro genótipo em competição, e consequentemente irá ocorrer uma redução do seu número. No ponto de equilíbrio o fitness de ambos os genótipos é idêntico, levando a um polimorfismo estável. Vários estudos demonstram a coexistência de genótipos diferentes mesmo em ambientes simples. Algumas sugestões foram sendo dadas na tentativa de explicar os mecanismos ecológicos que permitem a coexistência: (i) Trade-off demográfico, em que cada genótipo é especializado num diferente nicho ecológico (Levin, 1972, Helling, et al., 1987, Turner, et al., 1996, Rozen & Lenski, 2000). Por exemplo, um dos genótipos possui um maior fitness quando a glucose no meio é abundante, enquanto o outro genótipo possui um fitness mais elevado quando a glucose é escassa (Turner, et al., 1996); (ii) Cross-feeding, em que o genótipo com maior sucesso excreta um metabolito resultante do seu metabolismo ou morte celular para o meio. O segundo genótipo é eficiente a utilizar este metabolito (Turner, et al., 1996, Rozen & Lenski, 2000); (iii) Interacção antagonista, em que durante a fase estacionária um dos genótipos devido a uma mutação ou a um efeito pleiotrópico de uma mutação é capaz de inibir o genótipo mais frequente, interferindo com o seu crescimento máximo (Lemonnier, et al., 2008). Os mecanismos ecológicos acima descritos não se excluem entre si. Aliás, a ocorrência de um trade-off demográfico está geralmente associado a uma interacção por cross-feeding (Rosenzweig, et al., 1994, Turner, et al., 1996). No presente estudo demonstro a ocorrência de selecção dependente da frequência em bactérias resistentes a antibióticos. A resistência aos antibióticos pode resultar de mutações genéticas e/ou aquisição de determinantes de resistência por transferência horizontal de genes (revisto emMartinez, et al., 2009). As mutações que conferem resistência podem alterar processos fisiológicos da célula (Andersson & Levin, 1999). De forma similar, quando a resistência está localizada em elementos genéticos móveis (plasmídeos, integrões ou transposões), a replicação e expressão dos seus genes é responsabilidade da bactéria hospedeira. Tal irá interferir no crescimento normal da bactéria (Bjorkman & Andersson, 2000). Assim, um fenótipo resistente acarreta na maioria das vezes, custos para a bactéria, fazendo com que sofra uma diminuição do seu fitness (Andersson, 2006). Neste trabalho, utilizei bactérias resistentes a três antibióticos diferentes: ácido nalidíxico, rifampicina e estreptomicina. Para estes antibióticos a resistência é causada por mutações cromossomais em genes envolvidos na replicação (Marcusson, et al., 2009) , transcrição (Reynolds, 2000) e tradução (Kurland, et al., 1996), respectivamente. Estudos anteriores têm demonstrado que, face às alterações fisiológicas inerentes à resistência, bactérias resistentes em competição com bactérias sensíveis e na ausência de antibióticos, possuem uma desvantagem competitiva (Gillespie, 2001, Trindade, et al., 2009). Deste modo, a simples redução no uso de antibióticos deveria erradicar o grave problema das resistências aos antibióticos. Ou seja, as estirpes resistentes seriam eliminadas. Contudo, o cenário apresenta-se muito mais complexo (Johnsen, et al., 2009). Existem vários processos que permitem manter bactérias resistentes na população ao reduzirem ou eliminarem o custo provocado pelas mesmas: mutações compensatórias (Bjorkman & Andersson, 2000), epistasia entre resistências a antibióticos (Trindade, et al., 2009), mutações sem custo (Ramadhan & Hegedus, 2005, Criswell, et al., 2006) e co-selecção de resistências a antibióticos (Enne, et al., 2004, Andersson & Hughes, 2010). A ocorrência de selecção dependente da frequência aqui apresentada poderá ser um outro fenómeno. Os resultados aqui apresentados mostram que 13 dos 30 clones espontâneos (43%) resistentes a antibióticos testados apresentam um fenótipo de dependência na frequência quando em competição com um clone sensível. É de notar que, para as mesmas mutações pontuais nos genes envolvidos na resistência ao antibiótico respectivo, os clones resistentes apresentavam um comportamento diferente durante a competição. Isto sugere que o fenótipo para a dependência na frequência seria causado, não pelas mutações para a resistência, mas por outra qualquer mutação a ocorrer no cromossoma. Contudo, tal hipótese não ficou demonstrada. Relativamente, ao mecanismo ecológico responsável pela dependência na frequência sugeri a ocorrência de um cross-feeding ou uma interacção antagonista. Relativamente, ao cross-feeding os resultados não foram esclarecedores. No entanto, a hipótese de uma interacção antagonista, apesar de ainda não testada, aponta-se esclarecedora: os clones resistentes seriam portadores de uma mutação capaz de inibir os clones sensíveis através de um contacto célula a célula. Os resultados mostram uma incidência elevada de selecção dependente da frequência (43%) nos clones resistentes aos antibióticos. Tal incidência pode ser reflexo do método utilizado para selecção dos clones, o qual poderá estar a favorecer a selecção de clones com estas características. Apesar desta hipótese não estar ainda esclarecida, e portanto, desconhecermos se a selecção dependente da frequência tem uma baixa ou elevada incidência nas populações bacterianas resistentes, este estudo vem reforçar que a simples redução ou mesmo eliminação do uso de antibióticos não é uma medida eficaz no combate às resistências aos antibióticos. A ocorrência de selecção dependente da frequência em bactérias resistentes irá possibilitar a sua manutenção nas populações bacterianas, mesmo em baixas frequências. Assim que se reintroduzir novamente o antibiótico a resistência irá emergir em larga escala (De Gelder, et al., 2004). A selecção dependente da frequência deve ser um mecanismo considerado no estudo das dinâmicas das populações bacterianas e, em particular, nas populações resistentes aos antibióticos. Deste modo, torna-se necessário o desenvolvimento de novas terapêuticas alternativas aos antibióticos no combate às infecções bacterianas. Tal necessidade está na base do recente desenvolvimento de terapêuticas profiláticas, tais como a interferência bacteriana, vacinas bacterianas e a terapia fágica.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010
URI: http://hdl.handle.net/10451/2588
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