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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/2726

Título: Role of novel nuclear envelope proteins involved in nuclear positioning during cell migration
Autor: Pinto, Joana Borrego, 1986-
Orientador: Zilhão, Rita Maria Pulido Garcia, 1959-
Gomes, Edgar
Palavras-chave: Biologia molecular
Biologia celular
Fibroblastos
Migração celular
Centrossoma
Núcleo celular
Teses de mestrado - 2010
Issue Date: 2010
Resumo: Centrosome reorientation is defined as the positioning of the centrosome in a region between the nucleus and the leading edge and is important for cell polarization and directional cell migration. Cdc42 is the key regulator on this process and two main pathways are involved in centrosome reorientation; on one side, centrosome centration by a mechanism dependent of Par complex and dynein/dynactin, and for other side, a rearward nuclear movement dependent on Cdc42-effector MRCK and actin-myosin retrograde flow. Recently, the LINC complex was found to be involved in the rearward nuclear movement pathway. This complex spans the nuclear envelope and involves a SUN domain-containing protein which interacts with a KASH domain-containing protein, localized in the inner and in the outer nuclear membrane, respectively. SUN proteins bind to lamins and KASH proteins to actin filaments; in this way, the LINC complex makes the connection between actin retrograde flow and the nucleus. In fibroblasts, Sun2 and Nesprin-2 co-localize with dorsal actin cables on TAN lines; actin dorsal cables move back by actin retrograde flow and the nucleus moves with them. Other proteins can be involved in the nuclear movement. In a siRNA screen for nuclear envelope proteins, a putative role for Tmem201 in nuclear movement was identified. In S.pombe, Tmem201 homolog connects the heterochromatin with the LINC complex. A connection with LINC complex in mammalians was never reported so far. Tmem201is a nuclear envelope protein and is localized in TAN lines in fibroblasts. The TMEM201depletion by RNA interference inhibited centrosome reorientation. Tmem201 is involved in nuclear movement, probably by the stabilization of the LINC complex in the nuclear membrane. However, Tmem201 might also be involved in centrosome positioning and could act as a key regulator of both pathways.
Durante muito tempo, o papel do invólucro nuclear foi desvalorizado, sendo visto como um mero compartimento de armazenamento de cromossomas. Hoje em dia, após a descoberta de uma nova categoria de proteínas que permitiram criar o elo entre os componentes nucleares e o citosqueleto, o seu papel como organizador essencial é lhe amplamente reconhecido. De facto, a dinâmica entre citosqueleto e invólucro nuclear é fundamental para um correcto posicionamento do núcleo, que depende, por sua vez, de uma correcta migração e ancoragem do núcleo. O posicionamento nuclear é importante em fenómenos tão diversificados como a fertilização, a formação de fibras musculares, a oogénese e a migração celular. A reorientação do centrossoma é um processo que ocorre em fibroblastos, células endoteliais, células epiteliais, astrócitos, células T e neurónios e que leva à polarização celular. Considera-se que o centrossoma está orientado quando este se encontra posicionado entre o núcleo e a frente condutora da célula na migração. Pensa-se que a polarização do centrossoma é um fenómeno prévio à migração celular, importante para a orientação do Golgi, possibilitando a secreção polarizada de precursores membranares e de factores importantes para a frente da célula, possibilitando a migração. Durante muito tempo, pensou-se que seria o centrossoma a mover-se para uma posição anterior ao núcleo. Hoje em dia, sabe-se que é o núcleo que se move, adquirindo uma posição posterior ao centrossoma. A proteína Cdc42 tem um papel fundamental neste processo, conduzindo à activação dos dois mecanismos necessários à reorientação do centrossoma: por um lado, o centrossoma é mantido no centro da célula. Este mecanismo é dependente do complexo Par (Par6, Par3 e aPKC), da dineína e de dinactina. Por outro lado, MRCK, um efector de Cdc42, activa o movimento retrógrado do núcleo. Este movimento aparece aliado ao movimento retrógrado da actina, dependendo da contracção da miosina. Recentemente, um complexo de proteínas transmembranares do invólucro nuclear foi identificado como fundamental para este movimento nuclear. Este complexo é constituído por duas proteínas, uma com um domínio SUN e a outra com um domínio KASH, ambos localizados na extremidade C-terminal da proteína. Este domínio C-terminal é altamente conservado em todos os Metazoa e em leveduras. A proteína com domínio SUN localiza-se na membrana interna e interage com a lamina nuclear pela sua extremidade N-terminal. A proteína com domínio KASH localiza-se na membrana externa; algumas proteínas que contêm este domínio podem atingir dimensões de mais de 800kDa e podem interagir com a actina pelo seu domínio N-terminal. A localização da proteína com o domínio KASH na membrana externa é absolutamente dependente da proteína com o domínio SUN. Uma grande especulação existe ainda em torno da retenção da proteína com o domínio SUN na membrana nuclear. Em mamíferos, por exemplo, a localização de Sun2 parece ser parcialmente dependente da lamina nuclear, enquanto que Sun1 não depende da lamina para se localizar na membrana nuclear interna. Este complexo atravessa assim todo a membrana nuclear e estabelece assim a ligação entre o núcleo e a actina. Este par proteico é assim chamado de Complexo “LINC” – LIgação entre o Núcleo e o Citosqueleto (LInkers of Nucleoskeleton and Cytoskeleton). Um estudo recente reporta a implicação directa do complexo “LINC” na reorientação do centrossoma em fibroblastos de ratinho. Neste caso, o par de proteínas que está envolvido no movimento nuclear é Sun2/Nesprin-2. Este estudo descreve pela primeira vez a existência de cabos actínicos, organizados numa posição dorsal em relação ao núcleo, que se movem retrogradamente ao mesmo tempo do que o núcleo. Estes cabos, e logo também o movimento retrógrado de actina a eles associados, parecem ser o motor para o movimento nuclear. O envolvimento de Sun2 e Nesprin-2 é reportado, quando se observa que ambas as proteínas se co-localizam com estes cabos de actina e que a depleção destas proteínas inibe o movimento nuclear. Esta associação das proteínas do complexo LINC com os cabos dorsais de actina define uma nova estrutura nuclear denominada de “linhas TAN” – linhas Nucleares Transmembranares associadas a Actina (Transmembrane Actin-associated Nuclear). A força gerada pelo movimento retrógrado de actina é assim transmitida ao núcleo através destas estruturas, conduzindo ao movimento. Sabe-se que Sun2 e Nesprin-2 interagem no espaço perinuclear, mas pouco ainda se sabe sobre esta interacção. Para além do mais, a localização de Sun2 no invólucro nuclear continua mal elucidada. Para além disso, as forças aplicadas sobre estas proteínas durante o movimento nuclear, sugerem o envolvimento de outras proteína na estabilização, organização e interacção deste complexo. Num screen de siRNA para proteínas do invólucro nuclear, algumas proteínas revelaram um potencial papel no movimento nuclear, entre estas a proteína Tmem201. Esta proteína é conservada evolutivamente, estando presente em todos os Metazoa e ainda em S.pombe. Pouco se sabe ainda sobre esta proteína, havendo apenas dois estudos realizados até ao momento, um em S.pombe e outro em células humanas. Em S.pombe, o homólogo de Tmem201, Ima1, participa na associação da heterocromatina com o complexo LINC. Ima1 é importante para a estabilização do complexo, e de facto, quando é eliminada do sistema, observam-se deformações do invólucro nuclear e quebras no complexo LINC. Ima1 funcionará assim como estabilizador do complexo LINC à membrana, função ainda não atribuída a nenhuma outra proteína em mamíferos. Em células humanas, a proteína homóloga Samp1 aparece associada com estruturas membranares que se sobrepõem ao fuso mitótico. É também sugerido um possível papel desta proteína na ligação entre centrossoma e núcleo. Este trabalho propõe-se elucidar o envolvimento da proteína Tmem201 no movimento nuclear e na reorientação do centrossoma. Infelizmente, um anticorpo eficaz para a marcação de Tmem201 não está disponível no mercado e assim, um dos passos fundamentais deste trabalho passou pela produção de um anticorpo capaz de reconhecer eficazmente as três isoformas da proteína. Tal foi conseguido com sucesso, sendo possível visualizar perfeitamente uma marcação nuclear da proteína. Uma marcação a nível dos centrossomas, provavelmente não específica, foi também observada. Esta proteína também foi observada em associação aos cabos dorsais de actina que fazem parte das linhas TAN. Este fenómeno é particularmente interessante, se considerarmos que Sun2 e Nesprin-2 são as duas únicas proteínas que foram identificadas até ao momento com localização nestas estruturas. Tendo em conta que as laminas não se encontram nas linhas TAN, Tmem201 poderia funcionar como estabilizador do complexo LINC a este nível, num papel evolutivamente conservado ao papel de Ima1 em S.pombe. O movimento nuclear e da reorientação do centrossoma pode ser estudado facilmente através de um ensaio experimental em fibroblastos em cultura. Neste ensaio, é efectuado uma lesão linear (através de uma ponta de pipeta) numa monocamda confluente de células aderentes (em meio desprovido de soro). A reorientação do centrossoma é depois estimulada por adição de um factor específico (LPA). Através deste ensaio, procurou-se estudar os efeitos da depleção da proteína, por siRNA, na reorientação do centrossoma. Verificou-se uma inibição da reorientação do centrossoma quando a proteína não está presente, o que corrobora o resultado inicial do screen efectuado. Analisando a posição do centrossoma e do núcleo, uma forte inibição do movimento nuclear é visualizada, enquanto que a posição do centrossoma não é afectada. Os efeitos de depleção podem ser parcialmente recuperados aquando da microinjecção de um plasmídeo que codifica para a mais pequena isoforma de Tmem201 (Tmem201 B-GFP). Os resultados obtidos implicam o envolvimento de Tmem201 no movimento nuclear. Contudo, um resultado inesperado foi obtido, aquando da microinjecção do primeiro domínio da proteína: uma deslocalização do centrossoma. Este resultado sugere um possível envolvimento também no posicionamento do centrossoma. Através dos ensaios de microinjecção, foi também possível concluir que o primeiro domínio da proteína parece estar envolvido na localização nuclear da proteína (visto que Tmem201 628-GFP tem uma localização nuclear), enquanto que o segundo domínio da proteína deverá ter um papel no movimento do núcleo (visto que apenas a Tmem201 B-GFP é capaz de recuperar a reorientação do centrossoma). A inibição do movimento nuclear pode dever-se a diversos factores: se Tmem201 for importante na localização nuclear de proteínas envolvidas no movimento do núcleo, ou se por acaso levar à inibição do movimento retrógrado de actina. Verificou-se que a depleção de Tmem201 não afecta a retenção de Sun2, Nesprin-2, lamin A/C, lamin B e Emerin. Quanto à actina, não parece haver uma alteração do citosqueleto actínico. Em suma, Tmem201 aparece implicada na reorientação do centrossoma, mais precisamente no movimento nuclear. Tendo em conta que não afecta a localização de outras proteínas na membrana nuclear e não altera o citosqueleto actínico, Tmem201 poderá ter um papel como estabilizador do complexo LINC na membrana nuclear, sendo importante para o movimento nuclear. Contudo, poderá também estar envolvida no posicionamento do centrossoma. Tmem201 poderá assim actuar como proteína reguladora das duas vias.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010
URI: http://hdl.handle.net/10451/2726
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