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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/2734

Title: Synthetic pathogens for integrated biophysical and genetic dissection of antigen cross-presentation
Authors: Freitas, Rui Pedro da Silva Albuquerque e, 1980-
Advisor: Moita, Luís Filipe Ferreira, 1973-
Irvine, Darrell J.
Keywords: Antigénios
Sistema imunológico
Imunidade inata
Imunidade adaptativa
Receptores toll-like
Receptor 4 toll-like
Ovalbumina
Linfócitos T
Formação de anticorpos
Teses de doutoramento - 2010
Issue Date: 2010
Abstract: The study of host-pathogen interactions is crucial to unveil the diversity of the immune response outcome. Dendritic Cells (DCs) play a central role in the initiation and regulation of T-Cell immunity, functioning as master switches that control whether the outcome of antigen presentation results in tolerance, or immunity. Antigen cross-presentation is a necessary mechanism to generate immunity against tumors, bacteria and viruses. In addition, it is extremely important to induce cytotoxic immunity by vaccination with antigens. Moreover, particulate antigens have been used in vaccine design tools as a platform to deliver different types of signals and in the modulation of DC-dependent immune responses. DCs express a series of different receptors that mediate the transfer of signals from the environment. Among them, Toll-Like Receptors (TLRs) play a critical role in the early innate immune response to invading pathogens. These receptors have the ability to recognize a broad range of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), turning them, key receptors in distinguishing between self/non-self antigens. The precise mechanisms underlying the crosstalk between TLRs and antigen presentation are not entirely understood. Therefore, the main goal of this project is to understand how TLR agonists coupled to particulate antigens influence antigen cross-presentation. In our studies, we have used newly synthesized particle antigens, denominated as 'synthetic pathogens', coupled with a model antigen (Ovalbumin - OVA), and/or a model ligand (TLR agonist). These particle platforms have distinct, well-defined physical and biochemical properties, and function as a novel approach to elucidate the intrinsic mechanism(s) of antigen cross-presentation. In addition, they represent a valuable and powerful tool, which might be explored for therapy applications. TLR4 is unique among TLRs as it can signal through both MyD88 and TRIF adaptors upon LPS stimulation, but mainly by the TRIF pathway when LipidA is the agonist. Our results revealed that when LPS is in the same cargo as the particle antigen, it impairs antigen cross-presentation and dictates a shift to MHC class- II presentation. This antigen cross-presentation abolishment is recovered on TLR4 deficient DCs and in the presence of the p38 MAPK pathway inhibitor, but not in the absence of the MyD88 adaptor. Moreover, LipidA reproduces the same phenotype as LPS, implicating the TLR4/TRIF-mediated signaling on particulate antigen cross-presentation impairment. Thus, here we describe a new mechanism of antigen selection in DCs for antigen cross-presentation that is dependent on the antigen based-environment. We show that the efficiency of presenting antigens from phagocytosed cargo is dependent on the presence of TLR ligands within the cargo. The influence of the compartmentalization on the crosstalk between the TLR-signaling and the antigen cross-presentation pathway(s), may constitute a tool used by DCs in order to discriminate the contents of phagosomes and present an appropriate immune response to specific stimuli. Therefore, DCs may have the “capacity” to decide which kind of destiny an antigen should have depending on the type and origin of the stimuli. In order to dissect the mechanisms behind the cross-presentation phenotype, we have addressed the role of particle LPS on several antigen presentation key steps. Our data show that LPS-containing phagosomes enhance phagosome maturation (higher levels of colocalization with lysosomes) characterized by higher rates of phagosomal acidification and a decrease of phagosomal reactive oxygen species (ROS) production. The induction of phagosome maturation mediated by LPS signaling seems to shut down the machinery for antigen release into the cytosol, where the epitopes for MHC class-I are predominantly generated by the proteasome. Moreover, lower levels of antigen degradation occur when LPS is in the same cargo as antigen, mainly in a proteasome-dependent manner. This phenotype mediated by particulate LPS stimulus seems to be related with lower levels of particle antigen cross-presentation. Therefore, we propose that antigen cross-presentation is enhanced during the brief period of time when phagosomal acidification is “sustained” and an immature phenotype is predominant, where endoplasmic reticulum machinery important for MHC class-I presentation probably is available. In addition this phenotype allows antigen escape into cytosol and the generation of epitopes for MHC class-I by the proteasome. On the other hand, antigen cross-presentation is impaired when a stimulus that induces phagosome maturation/acidification is in the same cargo as the antigen, producing a mature phenotype, allowing the generation of epitopes on the endocytic pathway that is compromised for MHC class-II antigen presentation. In order to address if the abolishment on antigen cross-presentation phenotype is transversal to others TLRs, studies were extended using different TLR specific agonists. When particle antigen contains TLR agonists that preferentially signal through MAPK/NF-kB pathways, antigen cross-presentation is induced. In contrast, in the presence of TLR agonists that preferentially signals through IFN-Type I pathway, particle antigen cross-presentation is inhibited. Therefore, a signaling pathway correlation may exist in the outcome of antigen presentation pathway(s) mediated by TLR agonist-containing particle antigens. In sum, this work shows for the first time the inhibitory effect of TLR4 signaling on cross-presentation when agonists are delivered in the same cargo as particulate antigen. This phenotype is likely to be mediated by TRIF-dependent signaling, mainly by p38 MAPK activation. This knowledge could have a major impact in the dissection of the antigen cross-presentation mechanism, which will be highly valuable for novel vaccine design inducing T-Cell responses of the desired type and specificity.
O estudo das interações patogénio-hospedeiro é fundamental para a compreensão da diversidade da resposta imunitária e para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. As células dendríticas (DCs) desempenham um papel central na iniciação e regulação da imunidade mediada por linfócitos T, funcionando como “interruptores”, que podem originar uma resposta de tolerância ou imunidade em relação a um determinado antigénio. O mecanismo de cross-presentation de antigénios tem sido descrito como necessário para gerar imunidade contra tumores, bactérias e vírus, e fudamental na indução de imunidade citotóxica mediada por vacinação. Por outro lado, os antigénios particulados têm sido utilizados como ferramentas no design de vacinas, possibilitando uma plataforma na qual se podem integrar diferentes tipos de estímulos. As DCs expressam uma diversidade de receptores à superficie, o que permite uma detecção e transmissão eficazes dos vários tipos de “sinais” do meio ambiente. Entre eles, os Toll-Like Receptors (TLRs) desempenham um papel crucial, na resposta imune inata contra patogénios invasores. Estes receptores têm a capacidade de reconhecer uma ampla gama de padrões moleculares associados a patogénios (PAMPs), implicando-os como receptores-chave na distinção entre antigénios próprios e não-próprios. O mecanismo subjacente à crosstalk entre TLRs e a apresentação de antigénios não é totalmente conhecido. Por isso, um dos principais objetivos do meu trabalho foi compreender como é que os agonistas dos TLRs no mesmo contexto que antigénios particulados, influenciam a sua cross-presentation. Neste projecto foram utilizadas partículas sintéticas – designadas por synthetic pathogens - na presença de um antigénio modelo (Ovalbumina) e/ou de um ligando (agonista dos TLRs). Estas plataformas têm propriedades físicas e bioquímicas distintas e bem definidas, pelo que funcionam como uma nova abordagem para dissecar o mecanismo de cross-presentation de antigénios, bem como explorar o seu potencial para utilizaçao nas mais diversas terapias. Os resultados demonstram que quando o Lipopolissacarídeo (LPS - agonista do TLR4) está presente no mesmo contexto que as partículas contendo o antigénio, ocorre uma redução nos níveis de cross-presentation de antigénios. Este fenótipo é acompanhado por uma mudança na via de apresentação de antigénios para MHC classe- II, que é induzida quando comparada com as partículas só com o antigénio. Este mecanismo foi demonstrado como sendo mediado pelo TLR4, onde a cross-presentation de antigénios é restabelecida em DCs deficientes nesse receptor . A origem física dos estímulos (partícula vs solúvel) parece ser crucial para a regulação da via de cross-presentation de antigénios. Quando o LPS solúvel é co-incubado com partículas contendo o antigénio (dois estímulos físicos diferentes), verifica-se um aumento da activação/proliferação de células T em ambos os contextos de apresentação de antigénios - MHC classe-I e MHC classe -II. No entanto, quando o LPS é utilizado numa partícula diferente daquela que contém o antigénio, não se verificam diferenças significativas na eficiência das duas vias. A influência da compartimentação no crosstalk entre a sinalização mediada pelos TLR e a via de cross-presentation de antigénios, pode constituir uma ferramenta importante que as DCs utilizam para discriminar o conteúdo dos fagossomas e iniciar uma resposta imune apropriada aos estímulos específicos. Esta observação é de extrema importância para compreender o papel de estímulos "patogénicos" no destino da apresentação de antigénios. Com o objectivo de compreender o mecanismo adjacente ao fenótipo observado da via da cross-presentation de antigénios particulados, o papel da activação do TLR4 foi estudado em vários processos importantes na apresentação de antigénios. Os resultados obtidos indicam que fagossomas que contêm LPS têm uma indução na maturação (níveis mais elevados de colocalização com lisossomas), caracterizada por taxas mais elevadas de acidificação e uma diminuição da produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS). A indução da maturação dos fagossomas mediada pela sinalização por LPS parece bloquear o mecanismo de libertação do antigénio dos fagossomas para o citosol, onde os epítopos para a apresentação em MHC classe -I são predominantemente gerados pelo proteassoma. Para além disso, níveis mais baixos de degradação do antigénio, mediada principalmente pelo proteassoma, ocorrem quando o LPS está no mesmo contexto. Este fenótipo é devido à sinalização mediada pelo LPS e parece estar relacionado com níveis baixos de cross-presentation do antigénio particulado. Posto isto, sugerimos que a cross-presentation de antigénios é reforçada durante um breve período de tempo quando o pH dos fagossomas é mantido em valores próximos do estado basal, onde um fenótipo imaturo é predominante. Este estado imaturo é caracterizado pela existência de componentes do retículo endoplasmático (ER) importantes para a apresentação em MHC classe-I, permitindo o escape do antigénio para o citoplasma, onde os epítopos podem então ser gerados pelo proteassoma e apresentados no contexto MHC classe-I à superfície. Por outro lado, a cross-presentation de antigénios é diminuída quando um estímulo que induz a maturação dos fagossomas que contem o antigénio está no mesmo contexto. A formação de fagolisossomas leva à rápida acidificação e produz um fenótipo maduro, permitindo a geração de epítopos na via endocítica que é direccionada para a via MHC classe-II de apresentação de antigénios. O TLR4 é singular entre os TLRs, uma vez que pode sinalizar tanto pelo adaptador MyD88 ou pelo TRIF quando estimulado por LPS, mas preferencialmente pelo adaptador TRIF quando LipidA é o agonista. Com o objectivo de estudar o impacto da sinalização do TLR4 na via de cross- presentation dos antigénios particulados, o LipidA foi utilizado no mesmo contexto que o antigénio particulado. Observou-se uma reprodução do fenótipo de supressão da via de cross-presentation de antigénios obtido na presença do LPS. Além disso, a cross-presentation de antigénios particulados na presença de LPS não foi recuperada usando DCs deficientes no adaptador MyD88, ao contrário do que acontece quando se usa DCs deficientes no TLR4 e na presença de inibidores de activação da via das MAPK, principalmente a p38 MAPK. Estes resultados implicam a via TLR4/TRIF na inibição da cross-presentation de antigénios. Com o objectivo de verificar se o efeito inibitório na via de cross-presentation de antigénios é transversal aos outros TLRs, os estudos foram alargados usando agonistas dos diversos TLRs no mesmo contexto que as partículas de antigénio. Verificou-se que, os agonistas dos TLR que sinalizam preferencialmente através da via MAPK/NF-kB induzem a cross-presentation de antigénios particulados. Em oposição, os agonistas dos TLR que sinalizam preferencialmente através da via do IFN Tipo-I, levam à inibição da cross-presentation destes antigénios. O TLR4 pode sinalizar através dos dois adaptadores (MyD88 e TRIF) em diferentes localizações, sendo preferencialmente via TRIF quando o TLR4 é internalizado nos endossomas. A inibição da via de cross-preserntation de antigénios mediada pelo LPS quando no mesmo contexto que o antigénio particulado, poderia indicar que o LPS em partículas sinaliza preferencialmente através da via TRIF, quando estas são internalizadas. Esta observação corrobora os dados obtidos com os outros agonistas de TLR que preferencialmente sinalizam através da via do IFN Tipo-I, como é o caso do TLR3, do TLR7 e do TLR9, que estão localizados em endossomas. Conclui-se assim que os vários TLRs estão envolvidos em mecanismos diferentes que levam a efeitos distintos nas vias de apresentação de antigénios. Além disso, um padrão da via de cross-presentation de antigénios parece existir mediado por partículas contendo os vários agonistas dos diferentes TLRs. Em colaboração com o grupo do Prof. Darrell Irvine do MIT, pretendemos alargar estes estudos para outras plataformas de antigénios. Partículas de poli(ácido lático-co-ácido glicólico), PLGA, e hidrogel têm sido usadas como plataforma para administrar drogas, assim como em aplicações de biomateriais e concepção de vacinas. De acordo com os dados obtidos para a plataforma “fixa” de antigénios (partículas utilizadas nos ensaios anteriores), o LipidA no mesmo contexto que o antigénio particulado inviabiliza a via de cross-presentation de antigénios, comprovando a sua acção como um inibidor de sinalização mediada pelo TLR4, por um mecanismo dependente do adaptador TRIF. Assim, podemos concluir que mesmo na presença de partículas com propriedades distintas, a via mediada pelo adaptador TRIF tem um papel importante na inibição da via de cross-presentation de antigénios quando estimulada pelos agonistas do TLR4. Este trabalho mostrou pela primeira vez, o efeito inibitório da crosstalk entre a sinalização pelo TLR4 e a cross-presentation de antigénios quando os agonistas estão no mesmo contexto do antigénio particulado. Este fenótipo é susceptível de ser mediado pela via TLR4/TRIF, principalmente através da activação da via p38 MAPK. Estes resultados podem ter assim um impacto deveras importante na dissecção do mecanismo de cross-presentation de antigénios, assim como na concepção de novos protocolos de vacinação e na indução de respostas específicas mediadas por linfócitos T.
Description: Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Ciências Morfológicas), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2010
URI: http://hdl.handle.net/10451/2734
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