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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/2921

Título: Detecção de vírus implicados em infecções respiratórias e avaliação da sua diversidade em amostras clínicas
Autor: Mendes, Tatiana Micaela Tavares Cardoso, 1984-
Orientador: Gadanho, Mário
Tenreiro, Rogério Paulo de Andrade, 1955-
Palavras-chave: Biologia molecular
PCR
RT-PCR
Infecções respiratórias
Vírus
Teses de mestrado - 2010
Issue Date: 2010
Resumo: As infecções respiratórias do trato inferior (ITRI), constituem um problema de saúde pública. Embora na maioria dos casos o agente etiológico destas infecções permaneça desconhecido, o diagnóstico molecular dos agentes virais tem se mostrado eficiente. O principal objectivo deste estudo consistiu na avaliação da técnica de PCR e RT-PCR para detecção de vírus respiratórios, com primers desenvolvidos na Biopremier. Neste contexto, avaliaram-se os paramêtros que influenciam o bom desempenho da reacção de síntese de cDNA e de amplificação. Foram avaliados, quanto à eficiência, tempo de reacção e custo, 3 kits comercias para extracção de ácidos nucleicos: um para extracção de ácidos nucleicos em geral, outro para extracção de DNA e RNA separadamente, e por ultimo um específico para RNA. Constatouse que é possível utilizar material genético extraído por um kit para ácidos nucleicos em geral (não especifico para RNA) como template nas reacções de RT-PCR para detecção de vírus, independentemente do RNA presente ser ou não quantificável. Foram avaliadas quanto a sua performance duas transcriptases reversas: Tth e BioScript™, tendo em atenção as concentrações de MgCl2 e as temperaturas de annealing nas reacções de RTPCR. Uma vez que não se obtiveram quaisquer resultados satisfatórios com a Tth, foi selecionada a BioScript™ para o desenvolvimento dos protocolos de detecção dos vírus respiratórios incluídos no estudo. Foram efectuadas alterações ao protocolo original de síntese de cDNA com a BioScript™, permitindo incluir num único passo a adição de todos os reagentes, reduzindo desta forma o manuseamento das amostras e como tal o risco de contaminação, tornando a reacção mais rápida. Como conclusão deste trabalho, foram desenvolvidos protocolos de detecção por PCR de vírus da familia Herpesviridae e de detecção de hRSV e Influenza A por RT-PCR, utilizando a BioScript™ como transcriptase reversa. Foi ainda efectuado um estudo preliminar da frequência destes vírus (hRSV e Inf.A) em 50 amostras respiratórias provenientes de doentes hospitalizados com ITRI, tendo Influenza A sido detectado em 8/50 das amostras testadas e hRSV em 2/50. Contudo, e apesar dos resultados obtidos, mais estudos terão de ser efectuados, nomeadamente de comparação com as técnicas de diagnóstico existentes, de modo a avaliar os protocolos de detecção aqui desenvolvidos.
The lower respiratory tract infections (LRTI), constitute a public health problem. Although in most cases the etiologic agent of these infections remains unknown, the molecular diagnosis of viral agents has been proven effective. The main objective of this study was the evaluation of PCR and RT-PCR for detection of respiratory viruses, using primers developed in Biopremier. In this context, we evaluated the parameters influencing the performance of the reaction of cDNA synthesis and amplification. Were evaluated in terms of efficiency, reaction time and cost, three commercial kits for extraction of nucleic acids: one for the extraction of nucleic acids in general, one for extraction of DNA and RNA separately, and other specific for RNA. It was found that it is possible to use genetic material extracted by a kit for nucleic acids in general (not specific for RNA) as template in RT-PCR reactions for detection of viruses, regardless of the RNA present or not quantifiable. Were evaluated for their performance two reverse transcriptases: Tth and BioScript™, taking into account the concentrations of MgCl2 and annealing temperatures of the reactions of RT-PCR. Since satisfactory results were not obtained with Tth, BioScript™ was selected for the development of protocols for detection of respiratory viruses in the study. Changes were made to the original protocol for cDNA synthesis with the BioScript™, allowing to inclusion of all reagents in a single step, thus reducing the handling of samples and as such the risk of contamination, making the reaction faster. In conclusion of this work, protocols were developed for PCR detection of viruses of the family Herpesviridae and the detection of hRSV and Influenza A by RT-PCR, using as BioScript™ reverse transcriptase. Also a preliminary study of the frequency of these viruses (hRSV and Inf. A) in 50 respiratory samples from patients hospitalized with LRTI, Influenza A was detected in 8/50 samples tested and hRSV in 2/50. However, despite the results, more studies need to be done, particularly in comparison with the existing diagnostic techniques in order to evaluate the discovery protocols developed here.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010
URI: http://hdl.handle.net/10451/2921
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