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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/2969

Title: In vivo assays to study the interference of chemoprotectors on manganese neurotoxicity
Authors: Lucas, Rui Duarte Lourenço, 1984-
Advisor: Santos, Ana Paula Marreilha dos, 1957-
Dias, Deodália Maria Antunes, 1952-
Keywords: Bioquímica
Marcadores biológicos
Manganês
Manganismo
Stress oxidativo
Neurotoxicologia
Teses de mestrado - 2010
Issue Date: 2010
Abstract: O manganês (Mn) é um metal de transição de coloração branco acinzentado com propriedades semelhantes ao ferro e com uma distribuição ubíqua no ambiente. É importante para a fabricação de aços e de entre variadas aplicações, destaca-se a utilização em fertilizantes, produtos farmacêuticos, suplementos para animais e na produção de pilhas. Biologicamente o Mn é um oligoelemento e é essencial para todas as formas de vida, com importantes funções a nível do desenvolvimento e metabolismo. Dentro dessas funções destacam-se o papel fundamental do Mn no metabolismo de aminoácidos, hidratos de carbono e lípidos e em processos de protecção contra o stress oxidativo, nomeadamente como co-factor de enzimas tais como a superóxido dismutase (SOD). Em condições normais, e a nível ambiental, o Mn entra no organismo humano principalmente através da ingestão de alimentos e através das vias respiratórias, sendo normalmente absorvido a partir do tracto intestinal possivelmente por difusão passiva e transporte activo. Os níveis de Mn no organismo são ainda mantidos constantes por mecanismos homeostáticos que regulam não só a sua absorção como a sua excreção. No sangue, o Mn encontra-se principalmente nos eritrócitos e em níveis mais elevados é possível encontrá-lo no fígado, pâncreas, rins e cérebro. A distribuição do Mn varia de acordo com os diferentes tecidos, acumulando-se principalmente em tecidos ricos em actividade mitocondrial. Contudo, populações expostas, quer ambientalmente (através da água, alimentos e ar), quer ocupacionalmente (operários de indústrias metalúrgicas e mineiros) a níveis elevados de Mn, estão sujeitas a uma potencial exposição crónica com consequências muito nefastas para a sua saúde, principalmente a nível neurológico. Manganismo é o nome dado à intoxicação crónica neurodegenerativa causada pelo Mn e apresenta sintomas muito semelhantes à doença de Parkinson. Esta doença caracteriza-se pela acumulação de Mn em certas estruturas cerebrais, especialmente no sistema extrapiramidal, danificando progressivamente os neurónios dopaminérgicos nos gânglios basais, em zonas como o globus pallidus, striatum e substantia nigra. O cérebro é assim considerado o órgão alvo onde o Mn desenvolve a sua neurotoxicidade. A capacidade de atravessar as células endoteliais da barreira hematoencefálica permite ao Mn atingir zonas do sistema nervoso central e produzir os seus efeitos neurotóxicos, porém ainda não foram identificados os mecanismos exactos que permitem esse transporte. Apesar de muito estudado, o mecanismo pelo qual o Mn provoca a sua neurotoxicidade é pouco elucidativo. Um grande número de estudos indica o stress oxidativo como o principal factor de toxicidade do Mn, resultante de um aumento no número de espécies reactivas de oxigénio (ROS) intracelularmente e a consequente apoptose. Existem essencialmente dois mecanismos induzidos pelo Mn capazes de provocar stress oxidativo: oxidação da dopamina e acumulação de Mn na mitocôndria. No que respeita à oxidação da dopamina pensa-se que a sobreexposição ao Mn leva à alteração do sistema dopaminérgico e consequente degradação da dopamina, do seu precursor DOPA e de outras catecolaminas. Quanto à acumulação na mitocôndria, o Mn inibe a fosforilação oxidativa, interferindo com o metabolismo energético ao nível da glicólise e do ciclo do ácido cítrico. A interrupção das funções mitocondriais pode levar ao stress oxidativo e à consequente diminuição de mecanismos de defesa celular, nomeadamente à redução de antioxidantes como a glutationa (GSH), e posteriormente à deterioração do ADN mitocondrial por radicais livres. Na tentativa de prever e evitar os potenciais efeitos adversos a nível da saúde, o estudo de indicadores biológicos é fundamental para determinar os níveis de exposição ao Mn e para prever a potencial consequência na saúde. A procura de indicadores biológicos de exposição que reflictam os níveis de exposição de Mn a que as populações estão sujeitas tornou-se assim crucial no objectivo de controlar a neurotoxicidade do Mn. Diferentes biomarcadores de exposição têm sido usados, em vários estudos, com este intuito, no sentido de demonstrar que concentrações de Mn no sangue, cabelo, esmalte dos dentes e urina estão associadas com a exposição ao Mn, permitindo distinguir grupos expostos de não expostos. Contudo todos estes indicadores têm aspectos negativos que limitam o seu uso como indicadores biológicos de exposição absolutamente confiáveis. Dentro desses aspectos destaca-se principalmente a ausência de informação relativamente a exposições prévias ao Mn, uma vez que os dados oferecidos por estes indicadores se referem a exposições recentes. Além destes indicadores biológicos de exposição, existem também os biomarcadores de efeito que têm como objectivo último reflectir as mudanças/efeitos na saúde como consequência da exposição ao Mn. Como exemplo destes biomarcadores temos a GSH que participa em variadas reacções celulares, destruindo radicais livres e outras ROS, através de reacções enzimáticas. O stress oxidativo, resultante da neurotoxicidade do Mn, tem vindo a evidenciar um decréscimo nos níveis de GSH nas células, o que chamou a atenção para o uso desta molécula como indicador biológico de efeito. Também as concentrações de prolactina no soro têm sido usadas como indicadores da síntese dopaminérgica. A dopamina funciona como uma inibidora da libertação e síntese da prolactina da glândula pituitária, nomeadamente dos lactoforos. Tendo em conta que a exposição ao Mn causa alterações dos níveis de dopamina no cérebro, a produção de prolactina é um possível indicador da toxicidade do Mn e consequentemente um provável biomarcador efeito, já testado em variados estudos com correlações positivas e negativas. Apesar das variações de níveis destes propostos biomarcadores de efeito é de realçar que o stress oxidativo, como provável responsável das alterações mencionadas, faz parte de uma enorme quantidade de condições patológicas e neurotóxicas, acabando estes indicadores por ser uma medida indirecta do stress oxidativo em vez de uma medida da actividade oxidante. Com o objectivo de encontrar um possível tratamento que reduza ou elimine os efeitos da exposição crónica do Mn na saúde humana, propusemo-nos conduzir um ensaio de toxicidade sub-aguda in vivo de forma a analisar a interferência e possíveis efeitos protectores do antioxidante ebselen (EBS) e do agente quelante ácido para-aminosalicílico (PAS) na toxicidade do Mn, usando diferentes biomarcadores. Neste ensaio in vivo, ratos Wistar foram expostos a doses de Mn (cloreto de manganês) e co-expostos a Mn mais EBS via injecção intraperitoneal e ainda co-expostos a Mn mais PAS via injecção subcutânea. Avaliando a exposição ao Mn, os níveis de Mn no sangue e no cérebro foram determinados e verificou-se um aumento significativo quando comparados com o controlo (p<0.05), demonstrando neste caso serem biomarcadores de exposição bastante úteis. Para avaliar biomarcadores de efeito, os níveis de glutationa foram medidos no cérebro para determinar as consequências do stress oxidativo e foi observado uma diminuição significativa (p<0.05) nos ratos exposto a Mn, tal como observado noutros estudos in vitro e in vivo. Foram ainda determinadas as concentrações na urina de malonaldeído (MDA), um indicador da peroxidação lipídica, mas este não mostrou ser um biomarcador válido da toxicidade do Mn. Por outro lado, os níveis de prolactina no soro tiveram um aumento significativo (p<0.05) nos animais expostos ao Mn, o que demonstrou a capacidade da hormona prolactina em funcionar como indicador fidedigno da neurotoxicidade do Mn. Testes comportamentais e medições de peso também foram efectuados e foi observado um decréscimo significativo (p<0.05) na actividade motora e no peso ganho dos animais exposto ao Mn. No que diz respeito aos resultados da exposição ao Mn com os dois químicos seleccionados, na sua generalidade foi observado um efeito positivo e protector contra a toxicidade provocada pelo Mn, contra a acumulação de Mn no cérebro e níveis de Mn no sangue, destacando o PAS e o EBS como químicos a serem utilizados e investigados em estudos futuros. Por fim foi ainda observada uma correlação entre os níveis de Mn no cérebro e os níveis de prolactina no soro (r2=0,98) e também com os efeitos comportamentais (r2=0,87), mais uma vez realçando este biomarcadores como válidos e sólidos.
Manganese (Mn) is an essential metal in all forms of life; however chronic manganese exposure in workers may cause serious neurological problems, often leading to adverse health effects, namely manganism. Oxidative stress is one of the mechanisms of Mn-induced toxicity and is thought to occur by the generation of reactive oxygen species (ROS) which may eventually lead to cell death. These ROS can have their function inhibited by antioxidants because of their important ability to remove free radicals. The aim of this study was to analyze the interference and possible protective effects of the chemicals paminosalicylic acid (PAS) and ebselen (EBS) on Mn toxicity, using different biological indicators. In a sub-acute in vivo assay there were rats exposed to Mn alone (MnCl2, 10mg/kg) and co-exposed to Mn plus EBS (15 mg/kg) via intraperitoneal (i.p.) injection and co-exposed to Mn plus PAS (120mg/kg) by subcutaneous (s.c) injection. Mn levels in blood and brain were measured, both with significant increase when compared to control (p<0.05). Glutathione (GSH) levels were measured in brain to assess the consequences of Mn on oxidative stress and it was seen a significant decrease in the Mn exposed rats (p<0.05). Malondyaldehyde (MDA), a lipid peroxidation indicator, failed to be a valuable biomarker of Mn toxicity while, on the other hand, serum prolactin levels have shown a significant increase in the Mn exposed animals (p<0.05). Furthermore, it was observed a decrease in body weight gain and locomotor activity in the Mn treated animals (p<0.05). In general, a positive and protective effect against Mn-induced toxicity, brain Mn accumulation and Mn levels in blood was observed in the coexposed rats, pointing out PAS and EBS as chemicals to be used and investigated in further studies. Finally, it was observed a correlation between Mn levels in brain and the prolactin levels in serum (r2=0.98) and also with the behavioral effects (r2=0.87).
Description: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010
URI: http://hdl.handle.net/10451/2969
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