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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/2970

Título: Study of the biological cost of antibiotic resistance
Autor: Silva, Rui Francisco Ribeiro de Almeida e, 1980-
Orientador: Dionísio, Francisco, 1971-
Reis, Ana Maria Gonçalves, 1958-
Palavras-chave: Microbiologia
Plasmídeos
Transferência genética
Resistência aos antibióticos
Teses de mestrado - 2010
Issue Date: 2010
Resumo: Multi-drug resistance is caused by the accumulation of chromosomal mutations, by the acquisition of mobile genetic elements (mostly conjugative plasmids), or both. With few exceptions, the acquisition of drug-resistance mutations or of conjugative plasmids is costly to the bacterial cell in the absence of drugs. Recently, it has been found that, in Escherichia coli bacterial cells, a mutation conferring resistance to an antibiotic can be advantageous to the bacterial cell if another antibiotic-resistance mutation is already present, a phenomenon called sign epistasis. Here we show that sign epistasis is even more common in the interaction between antibiotic-resistance chromosomal mutations and conjugative plasmids, as well as an overall antagonistic interaction between mutations and plasmids. This implies that the acquisition of an additional resistance plasmid or of a resistance mutation often increases the fitness of a bacterial strain already resistant to antibiotics. These results further complicate expectations of resistance reversal by interdiction of antibiotic use.
Os antibióticos são essenciais na medicina moderna (Martinez et al., 2009). A sua utilização permite a prevenção e tratamento de infecções bacterianas. Desde o inicio da era dos antibióticos que se observa a emergência e disseminação de estirpes bacterianas resistentes (Levy & Marshall, 2004). Actualmente, o ritmo de descoberta de novas drogas com actividade antimicrobiana é muito lento, logo, a sociedade moderna enfrenta novamente um desafio no combate contra as doenças infecciosas de origem bacteriana. A resistência a antibióticos pode resultar de dois processos distintos: i) mutação espontânea de genes cromossomais (Martinez et al., 2009) ou ii) aquisição de genes de resistência localizados em elementos genéticos móveis (Martinez et al., 2009). Este estudo foca-se em mutações em três genes de housekeeping: rpsL, gyrA e rpoB. Mutações no gene rpsL podem modificar a proteína S12, um dos constituintes da subunidade ribossomal 30S, conferindo resistência à estreptomicina (Schrag et al., 1997). O gene gyrA codifica a enzima ADN girase, envolvida na síntese de ADN e mutações neste gene resultam em resistência a quinolonas como o ácido nalidíxico (Emmerson & Jones, 2003). A resistência à rifampicina pode resultar de mutações no gene rpoB que modificam a subunidade  da polimerase de ARN, envolvida na transcrição de ADN (Trinh et al., 2006). Sistemas celulares de detecção e correcção de erros no ADN permitem manter a taxa de mutação em níveis baixos. No entanto, ambientes com uma forte pressão selectiva (como uma infecção crónica sujeita a tratamento com antibióticos), contribuem para a selecção de fenótipos com uma elevada taxa de mutação (LeClerc et al., 1996; Oliver et al., 2000; Vulic et al., 1997). As mutações de resistência afectam genes “essenciais” (normalmente denominados de housekeeping, termo utilizado doravante) que codificam alvos de antibióticos (Andersson & Levin, 1999; Higgins et al., 2003). Logo, a resistência está frequentemente associada a um desvio da fisiologia óptima da célula. Devido a isso, estirpes resistentes a antibióticos frequentemente exibem uma taxa de crescimento menor que as estirpes ancestrais susceptíveis (Andersson & Levin, 1999; Andersson, 2006; Lenski, 1998; Nilsson et al., 2003). Esta diferença corresponde ao custo biológico (normalmente denominado de custo de fitness, termo utilizado doravante) da resistência a antibióticos. A grandeza do custo de fitness varia entre estirpes e mutações e, em alguns casos, a mutação de resistência pode não criar qualquer custo mensurável. O custo de fitness afecta a frequência de uma determinada estirpe bacteriana na população, observando-se que estirpes com menor custo de fitness exibem uma maior frequência que estirpes resistentes com um elevado custo de fitness (O'Neill et al., 2006; O'Sullivan et al., 2005). Num ambiente não sujeito à pressão selectiva de um determinado antibiótico, é espectável que as estirpes susceptíveis exibam uma taxa de crescimento superior à das estirpes resistentes, conduzindo à eliminação do fenótipo resistente. Logo, uma possível estratégia para eliminar a resistência a antibióticos consiste em banir a utilização de um determinado antibiótico. Infelizmente, vários fenómenos podem minar a eficácia deste tipo de estratégia. A evolução de estirpes resistentes conduz frequentemente à redução ou eliminação do custo biológico associado com a mutação de resistência (Andersson & Levin, 1999; Bjorkman et al., 2000; Emmerson & Jones, 2003; Gagneux et al., 2006; Maisnier-Patin et al., 2002; Schrag et al., 1997). Este processo é o resultado da ocorrência de mutações espontâneas compensatórias, que podem ocorrer noutros locais do cromossoma. A ocorrência de mutações compensatórias é muito mais frequente que a ocorrência de mutações de reversão para a susceptibilidade devido ao muito maior alvo para mutações compensatórias (todo o cromossoma). A resistência produzida pela aquisição de genes de resistência está relacionada com a troca horizontal de elementos genéticos como integrões, transposões e plasmídeos (Martinez et al., 2009). Os integrões exibem um arranjo modular que permite a introdução e expressão de genes. Integrões são recrutados por transposões, que por sua vez são recrutados por plasmídeos (Carattoli, 2001). Os plasmídeos conjugativos são capazes de mobilizar o seu ADN (e a de outros plasmídeos - plasmídeos mobilizáveis) de uma célula dadora para uma célula recipiente através do processo da conjugação bacteriana (Amabile-Cuevas & Chicurel, 1992). A conjugação permite a troca de genes de resistência entre estirpes bacterianas diversas contribuindo para a disseminação do fenótipo resistente no ambiente. A manutenção, replicação e expressão do plasmídeo de resistência também pode produzir um custo biólogico, expresso numa menor taxa de crescimento da estirpe contendo o plasmídeo em relação à mesma estirpe sem o plasmídeo. Logo, também na resistência a antibióticos produzida pela disseminação de plasmídeos de resistência, é possível conceber como estratégia para a eliminação da resistência, a suspensão da utilização de um determinado antibiótico. Este cenário é, no entanto, tornado mais complexo devido a vários fenómenos. A evolução conjunta de um plasmídeo e da sua estirpe hospedeira conduz frequentemente à redução ou eliminação do custo de fitness (Bouma & Lenski, 1988; Dionisio et al., 2005). Por outro lado, a presença no plasmídeo de outros genes seleccionados pelo ambiente (por exemplo, resistência a metais pesados) impede a eliminação do plasmídeo da população (Martinez & Baquero, 2002). Adicionalmente, a existência de estirpes bacterianas com uma capacidade dadora mais elevada permite que estas estirpes tenham um efeito amplificador, conduzindo a uma rápida disseminação do plasmídeo (Dionisio et al., 2002). Finalmente, a presença de sistemas estabilizadores de plasmídeos, como por exemplo o sistema de morte pós-segregacional, também dificulta a sua eliminação de uma população (Engelberg-Kulka & Glaser, 1999). Recentemente, um estudo revelou um fenómeno adicional que complica a reversão para a susceptibilidade em estirpes multi-resistentes: a ocorrência de uma interacção antagonística entre alelos de resistência conduzindo a um custo de fitness menor que a soma independente do custo de fitness associado com cada um dos alelos de resistência, quando isolados (Trindade et al., 2009). A observação deste fenómeno de epistasia positiva entre mutações deletérias sugere que a interacção entre alelos de resistência pode ser um dos fenómenos contribuindo para a manutenção da resistência a antibióticos em populações bacterianas. O presente estudo pretende averiguar se ocorrem interacções entre mutações cromossomais de resistência e plasmídeos conjugativos e entre plasmídeos conjugativos co-existindo na mesma célula. Nesse sentido, o custo de fitness associado a seis plasmídeos conjugativos de resistência foi determinado utilizando o mesmo ensaio de fitness utilizado no estudo de Trindade e tal (Trindade et al., 2009). De seguida, através de conjugação, foram produzidas todas as combinações possíveis entre 10 mutações e 5 plasmídeos e todas as combinações possíveis entre 6 plasmídeos. O fitness de cada estirpe resultante foi medido e utilizado para detectar e medir possíveis interacções epistásticas. Os resultados mostram que 52% (26/50) das combinações entre mutação e plasmídeo exibem epistasia positiva. Adicionalmente, 16 destas 26 estirpes exibindo epistasia positiva (62%), também exibem epistasia de sinal. Tal significa que o custo de fitness associado aos 2 determinantes de resistência em conjunto é menor que o custo de fitness associado a um dos determinantes isolados. Do mesmo modo, observou-se a ocorrência de epistasia positiva em 6 das 14 combinações entre plasmídeos co-existindo na mesma célula. Os resultados revelam também que mutações mais deletérias tendem a ser mais epistáticas que mutações com menor custo de fitness. Por outro lado, a comparação entre o efeito das mutações e dos plasmídeos no nível de epistasia, sugere que as mutações são mais determinantes do nível de epistasia que os plasmídeos. O presente trabalho mostra que as interacções epistáticas não se limitam a mutações mas também envolvem plasmídeos. A ocorrência de epistasia de sinal entre mutações e plasmídeos sugere que em determinados casos, a aquisição de um determinante de resistência adicional pode conduzir a um aumento da taxa de crescimento da estirpe (aumento de fitness). Dado o papel fundamental desempenhado pelos plasmídeos como vectores na disseminação da resistência a antibióticos, os resultados aqui descritos mostram a necessidade de implementar estratégias para a reversão para a susceptibilidade que tenham em conta a complexidade da ecologia evolutiva das estirpes resistentes. Sugerimos a implementação de medidas para a reversão que estejam direccionadas contra as vulnerabilidades dos plasmídeos conjugativos. Três estratégias foram já identificadas (Williams & Hergenrother, 2008): i) inibição da conjugação bacteriana; ii) inibição da replicação do plasmídeo e iii) exploração dos sistemas toxina-antitoxina codificados pelo plasmídeo.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010
URI: http://hdl.handle.net/10451/2970
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