Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/30409
Título: Geometric morphometric and genetic diversity analyses of two small mammal populations from heavy metal mines in Portugal
Autor: Durão, Ana Filipa Lopes
Orientador: Quina, Ana Sofia Magueijo Pais,1972-
Mathias, Maria da Luz,1952-
Palavras-chave: Mus spretus
Crocidura russula
Pequenos mamíferos
Metais
Biomarcadores
Teses de mestrado - 2017
Data de Defesa: 2017
Resumo: A indústria mineira tem tido ao longo dos últimos séculos um papel preponderante no desenvolvimento económico dos países. Contudo a sua intensa atividade tem deixado marcas profundas no ambiente tanto durante o seu período de exploração, como após o seu encerramento, sendo hoje em dia considerada uma das maiores fontes de poluição antropogénicas de metais. Durante os processos de britagem e moagem muitos materiais não são recuperados, sendo depositados em escombreiras. Estes locais sujeitos à ação dos elementos tornam-se fontes imprevisíveis de contaminação de água, solo, vegetação e atmosfera, representando sérios riscos ao nível biológico e ecológico. Esta exposição a metais, seja a metais pesados ou a elevadas concentrações de metais essenciais, tem efeitos tóxicos imediatos sobre os indivíduos ou a médio-longo prazo sobre as populações ou comunidades. Um dos efeitos deletério é a sua capacidade para aumentar a formação de espécies reativas de oxigénio induzindo stress oxidativo nos animais. Este efeito pode ter implicações nas células somáticas, podendo originar doenças degenerativas, processos carcinogénicos e mutagénicos (com possíveis consequências para a fitness das populações naturais) ou ao nível das células germinativas, prejudicando a geração seguinte. Em ambos os casos estas alterações poderão ter resultados demográficos na população. O stress ambiental causado pelos metais pesados pode afetar a composição das populações de maneiras distintas: através do aumento da taxa de mutação e/ou alteração da taxa de migração (gene flow) ou através de eventos de bottleneck (deriva genética) e/ou seleção de genótipos tolerantes (seleção natural). Esta alteração do padrão genético poderá ter consequências tanto ao nível fisiológico como morfológico. O uso de sentinelas é fundamental para este tipo de estudos toxicológicos, permitindo uma visão holística do impacte negativo que os metais têm no ambiente e na saúde humana. Devido à importância que têm na cadeia alimentar introduzem a componente espacial e temporal na análise, algo que não é possível através de uma análise química direta no ambiente. O uso de biomarcadores permite detetar e quantificar o efeito da exposição aos metais ao longo dos diferentes níveis de organização biológica. Embora se saiba que os metais pesados têm efeitos negativos nos indivíduos, poucos estudos têm sido realizados em pequenos mamíferos a níveis de organização biológica superiores, ainda sendo limitado o conhecimento que o efeito crónico à exposição dos metais pesados pode ter nas populações. Neste contexto a presente tese pretendeu entender qual o impacto que os metais têm sobre a biodiversidade, através da análise das alterações ao nível morfológico e genético. Este tipo de estudos permite analisar de uma maneira indirecta o risco para a saúde humana. No presente trabalho, foram estudadas duas espécies de pequenos mamíferos Crocidura russula (Hermann, 1780) e Mus spretus (Lataste, 1883), já anteriormente usados em estudos de biomonitorização. Estas duas espécies têm um tempo geracional muito curto, o que faz por exemplo, com que pressões ambientais possam gerar rápidas mudanças na história evolutiva destas espécies, fazendo delas bons biomonitores de estudos de ecotoxicologia evolutiva. Os animais do presente estudo foram capturados entre 2002 e 2003 em duas minas localizadas a sudeste de Portugal, a mina de Aljustrel e a mina da Preguiça, e numa zona de referência para fins comparativos (Moura). A mina de Aljustrel é uma mina que se localiza na Faixa Piritosa Ibérica. Esta operou intensamente entre 1867 a 1996 (ano em que cessa atividade), extraindo cobre, zinco, chumbo e prata. É uma área que apresenta uma profunda alteração e degradação da paisagem, reflexo dos longos anos de exploração. A mina da Preguiça é uma mina localizada na Zona da Ossa Morena, tendo estado ativa entre 1911 e 1964 e extraído essencialmente zinco e chumbo. Este local não aparenta grandes sinais de degradação ambiental tendo a vegetação invadido a mina e escondido escorias e resíduos existentes. Estudos anteriores realizados nestes locais mostraram que comparativamente com área de referência ambas as minas apresentaram elevadas concentrações de zinco, arsénio e chumbo nos solos, juntamente com zinco e chumbo nas plantas. Alterações bioquímicas (níveis de metalotioninas, atividade enzimática antioxidante), histológicas (rins e fígado), fisiológicas (parâmetros morfológicos e hematológicos) e um aumento da frequência de micronúcleos foram observadas nestas mesmas minas em Crocidura russula e Mus spretus. Partindo deste conhecimento, o principal objetivo da presente tese foi avaliar qual o efeito dos metais pesados a longo-médio prazo em duas populações de pequenos mamíferos que vivem em minas abandonadas, recorrendo a biomarcadores genéticos e análise de morfometria geométrica. A estrutura escolhida para a análise morfológica foi a mandíbula devido a ser uma estrutura amplamente usada em diversos estudos, nomeadamente em estudos toxicológicos. É uma estrutura composta só por um osso que apresenta uma estrutura plana, permitindo a aplicação de uma análise de morfometria geométrica em 2D. Esta análise foi realizada unicamente em Mus spretus devido ao limitado número de exemplares de Crocidura russula existentes na zona de referência. Um total de 124 indivíduos adultos foram analisados (mandíbula esquerda e direita), tendo sido todas as mandíbulas limpas através do método de água fervente. Posteriormente foram digitalizadas e colocado 19 landmarks sobre cada mandibula usando software específico. Para analisar a forma os landmarks foram decompostos em size e shape, tendo sido a variação na shape analisada na mandíbula como um todo e em cada módulo funcional separado (ramo ascendente e a região alveolar). O tamanho da mandíbula foi obtido pelo centroid size. Para explorar as diferenças da shape e avaliar as distâncias morfológicas entre populações foi realizado uma análise da variante canónica para a componente simétrica e assimétrica. Por fim como biomarcador da instabilidade do desenvolvimento, foi calculado a assimetria flutuante para os três locais, tendo sido realizado um teste estatístico. As evidências para as mudanças genéticas populacionais nas duas espécies foram investigadas usando parâmetros de diversidade de dois marcadores mitocondriais sujeitos a pressões seletivas diferentes, o gene citocromo b (Cyt b) e a região controlo. O ADN genómico foi extraído de 63 Crocidura russula e 75 Mus spretus, tendo sido os fragmentos de ADN mitocondrial amplificados através de reações em cadeia da polimerase, utilizando primers específicos. Os produtos obtidos foram purificados e sequenciados. As sequências obtidas foram editadas, alinhadas e comparadas com as sequências existentes no GenBank. No caso de Crocidura russula, uma vez que o comprimento da região controlo é muito variável mesmo dentro de um indivíduo (heteroplasmia de tamanho), a região controlo foi aqui usada como “marcador genético neutro”. Como parâmetros de diversidade genética foram analisados: a diversidade haplótidica, nucleótidica, número de haplótipos, substituições sinónimas e não sinónimas, variable sites e mismatch distribution, enquanto a análise da estrutura populacional foi avaliada através da variação genética entre e dentro das populações por uma análise da variância molecular e pela relação entre haplótipos estabelecida pela rede de haplótipos. Os resultados deste estudo confirmaram que para além de existirem alterações a nível individual, tanto as populações de Crocidura russula como Mus spretus nas duas minas estudadas estão a sofrer impactos negativos a outro nível de organização biológica. As análises morfológicas em Mus spretus revelaram diferenças entre as três populações e proximidade morfológica entre locais contaminados, embora se tenha verificado uma aproximação genética maior entre local de Referencia e a Mina da Preguiça. Estas mudanças morfológicas sugerem que a baixa qualidade ambiental está a atuar de uma forma direta e indireta, através da disponibilidade de recursos entre os diferentes locais. Ao nível da assimetria flutuante não foram encontradas diferenças significativas entre as populações, o que pode estar relacionado com a sensibilidade da mandíbula a perturbações ambientais ou à sazonalidade da biodisponibilidade dos metais. Baseado no gene Cytb, ambas as espécies na mina de Aljustrel apresentaram altos valores de diversidade genética possivelmente devido ao gene flow das populações circundantes, atuando este lugar como um ecological sink. Os baixos valores registados em Cytb juntamente com os “marcadores genéticos neutros” da região controlo sugeriram que a população da mina de Preguiça, possivelmente num passado recente sofreu um bottleneck, tendo sido recolonizada por indivíduos de populações próximas como a zona de referência. Esta diminuição populacional possivelmente deveu-se a um aumento da taxa mutacional nesta população, o qual é sugerido pelo aumento da diversidade genética na região controlo. Os nossos resultados confirmam o impacto potencial que as minas abandonadas têm ao nível individual e ao nível das populações, permanecendo activos os efeitos nocivos da actividade mineira. Estes resultados reforçam a importância de planos de recuperação ou ações de remediação nas minas abandonadas, de modo a mitigar os efeitos adversos dos metais pesados. Uma vez que a resposta populacional nas duas espécies foi coincidente, conclui-se que as diferenças registadas são devido às diferentes características das minas, reforçando a importância das distintas variáveis que podem influenciar as respostas da população e que fazem os estudos de toxicologia evolutiva complexos. Por fim, este estudo corroborou a sustentabilidade das duas espécies usadas como bons biomonitores da qualidade ambiental, assim como o uso de biomarcadores genéticos e morfométricos para a identificação dos efeitos toxicológicos ao nível da população.
Portugal has a long history of mining. Nonetheless, a decline in this activity has been observed over the last decades, with consequent abandonment of mining areas without recovery plans. Abandoned mines constitute one major environmental problem since they are unpredictable sources of metal pollution. Although environmental pollution may have effects at all levels of biological organization, few studies have been performed on high organizational levels, like the population level, so that the chronic effect of metal toxicity remains largely unknown. To understand the medium-long term impact of metals on biodiversity, in this study it was performed geometric morphometric and genetic analyses of the populations of two mammalian sentinel species (Mus spretus and Crocidura russula) living in two heavy metal polluted mines in southern Portugal (Aljustrel mine, deactivated since 1996, and Preguiça mine, deactivated since 1964), that were previously shown to harbour changes at the biochemical, histological and physiological levels. We observed that the morphological analysis in Mus spretus revealed mandibular morphological differences in the three populations and a greater morphological similarity between the animals from mines. These morphological changes may be associated with the low environmental quality in mines. In the Aljustrel mine, both species showed higher genetic diversity in the Cytochrome b gene, while in the populations from Preguiça, the diversity of the Cytochrome b gene and of the mitochondrial control region changed in opposite directions, high genetic diversity in the latter, and low diversity in Cytb. These results suggest that Aljustrel may have functioned as an ecological sink and that in Preguiça a bottleneck may have occurred in the recent past, possibly due to an increase in the mutational rate. Our results confirmed the potential environmental impact of mines at the individual level and showed that within a relatively short time, pollution by heavy metals had altered normal homeostatic pathways and the genetic structure of natural populations. Since the effects on the populations of both species were concordant, it may be concluded that the different responses are due to the different characteristics of each mine. This study also corroborates the sustainability of these two species as biomonitors of environmental quality and the use of genetic and morphological biomarkers in identifying toxicological effects at a population level. Ecotoxicological studies such as this have the potential to assess the impact of anthropogenic stress on the evolutionary history of natural populations, as well as to reinforce the importance of requalification plans or remediation actions in abandoned mines.
Descrição: Tese de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017
URI: http://hdl.handle.net/10451/30409
Designação: Mestrado em Biologia Humana e Ambiente
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