Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/30441
Título: Propriedades anticancerígenas de um óleo esssencial: identificação de compostos e avaliação de actividades biológicas
Autor: Silva, André Filipe Couto Cardoso da
Orientador: Pacheco, Rita Isabel Dias, 1974-
Serralheiro, Maria Luísa, 1957-
Palavras-chave: Nigella sativa
Óleo
Voláteis
Bioatividade
Perfil proteico
Teses de mestrado - 2017
Data de Defesa: 2017
Resumo: Com o avanço na medicina, são também, cada vez mais procuradas soluções naturais contra as doenças, face ao receio que existe dos fármacos sintéticos. O óleo de sementes de Nigella sativa é usado tradicionalmente sendo-lhe reconhecidas inúmeras propriedades e muitas atividades biológicas como antioxidante, anticancerígena, entre outras. Através da colaboração do Laboratório de Metabolismo de Compostos Fenólicos com o Professor Dr. Parvez Haris da De Montfort University, Reino Unido, surgiu o âmbito deste trabalho, o estudo do potencial deste óleo. Em trabalhos preliminares, notou-se que seria possível que as propriedades do óleo pudessem ser provenientes dos seus compostos voláteis. Como tal, foram identificados todos os compostos presentes no óleo e destes, os que foram removidos ao evaporar os voláteis e, posteriormente, realizados ensaios a diversas atividades biológicas para o óleo com e sem voláteis. Foram identificados os seguintes compostos no óleo com voláteis: α-tujeno, α-pineno, sabineno, 3-careno, cimeno, γ-terpineno, hidrato de trans-sabineno, timoquinona, timol, α-longipineno, longifoleno, ácido palmítico, etil linoleato e metil linoleato, no entanto quando analisado o óleo sem voláteis foi notório que o α-tujeno, α-pineno, sabineno e 3-careno foram completamente removidos, a quantidade de cimeno e γ-terpineno encontrou-se muito diminuída e o hidrato de trans-sabineno e a timoquinona ligeiramente diminuídos, relativamente ao óleo com voláteis Nos estudos de atividade antioxidante, verificou-se um EC50 de 6,74 ± 0,57 μg/mL e 7,71 ± 0,30 μg/mL para o óleo com voláteis e sem voláteis, respetivamente, o que significa que existiu uma pequena diminuição de atividade antioxidante com a remoção dos voláteis do óleo. Na peroxidação lipídica, foi determinado um EC50 de 51,77 ± 5,17 e 40,18 ± 0,47 μg/mL para o óleo com e sem voláteis, respetivamente. Num estudo preliminar acerca da inibição da atividade da 3-hidroxi-3-metilgluraril-coenzima A redutase (HMGCR), a concentração de 5,56 μg/mL apresenta cerca de 90% de inibição para o óleo com voláteis e cerca de 16% para o óleo sem voláteis. No estudo da inibição da atividade da acetilcolinesterase (AChE), obteve-se um IC50 de 0,1782 ± 0,0206 μg/mL para o óleo com voláteis e o óleo sem voláteis não apresentou qualquer tipo de inibição. Quanto aos testes de citotoxicidade contra linhas celulares do cancro da mama (MCF-7) e do melanoma (A375), o óleo com voláteis apresentou um LC50 de 1,64 ± 0,38 μg/mL e 1,28 ± 0,08 μg/mL, respetivamente. O óleo sem voláteis, para ambas as linhas celulares, não apresentou qualquer tipo de atividade citotóxica, no caso da linha celular MCF-7, o óleo pareceu, em oposição, potenciar o crescimento das mesmas. Com esta análise, foi possível verificar que o método de remoção dos voláteis do óleo resultou, na maioria dos casos, numa perda das atividades biológicas associadas ao óleo com voláteis, o que indica que a maior parte das atividades estudadas é proveniente dos compostos mais voláteis do óleo. Foi estudado também o perfil proteico da linha celular A375 em contacto com o óleo com voláteis por PAGE-nativa verificando-se um aumento da expressão de duas proteínas, a POTE anquirina, membro da família de domínio F, que é frequentemente associada à apoptose, e a HSP 90-β, que é sobre-expressa quando ocorre stresse celular. Deste modo pode-se propor que as células A375 foram eliminadas por apoptose e sujeitas a stresse celular quando em contacto com o óleo o que justifica a sua elevada citotoxicidade. Estudou-se ainda, através de espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier acoplada a refletância total atenuada (FTIR-ATR), as alterações na estrutura de duas proteínas modelo, a albumina do soro bovino (BSA) e lisozima (Lys), em contacto com o óleo com voláteis, e foi verificado que a BSA não sofreu alterações nos ensaios realizados, no entanto, os compostos voláteis mostram ter uma capacidade de proteger a estrutura secundária da Lys, o que pode levar à prevenção da agregação desta. Em conclusão, este inovador estudo sobre o óleo da Nigella nativa revelou-se de extrema importância para identificar os compostos no óleo que poderão estar associados às propriedades biológicas exibidas, complementando estudos anteriores, e para perceber as modificações sobre as proteínas das linhas celulares humanas em contacto com o óleo que poderão justificar algumas das suas bioatividades.
With the advance of medicine, natural pharmaceuticals are becoming more popular with the growing fear of the synthetic drugs. The oil from the seeds of Nigella sativa is traditionally used and has a lot of proprieties and biological activities like antioxidant, anticancer, among others. Through the collaboration of the Laboratório de Metabolismo de Compostos Fenólicos with Professor Dr. Parvez Haris of De Montfort University, United Kingdom, the theme of this work emerged, the study of the potential of this oil. In preliminary work, it was noticed that the properties of the oil might be coming from the volatile compounds. As such, all the compounds of the oil were identified and from these, the ones that were removed with the evaporation of the volatiles and then, studies of different biological activities were made to the oil with and without the volatiles. The following compounds were identified in the oil with volatiles: α-thujene, α-pinene, sabinene, 3-carene, cymene, γ-terpinene, trans-sabinenehydrate, thymoquinone, thymol, α-longipinene, longifolene, palmitic acid, ethyl linoleate and methyl linoleate, however, when studying the oil without the volatiles, α-thujene, α-pinene, sabinene and 3-carene were completely removed, cymene and γ-terpinene were present in a very small quantity and trans-sabinenehydrate and thymoquinone were just slightly below the oil with volatiles. In the antioxidant studies, the EC50 was 6,74 ± 0,57 μg/mL and 7,71 ± 0,30 μg/mL to the oil with a and without the volatiles, respectively, which means that there is a small loss of activity with the removal of the volatiles. To the lipid peroxidation, the EC50 was 51,77 ± 5,17 and 40,18 ± 0,47 μg/mL to the oil with volatiles and without volatiles, respectively. In a preliminary study about the inhibition of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase (HMGCR), a concentration of 5,56 μg/mL shows approximately 90% of inhibition to the oil with volatiles and about 16% to the oil without volatiles. In the study of the inhibition of acetylcholinesterase (AChE), the IC50 was 0,1782 ± 0,0206 μg/mL to the oil with volatiles and the oil without volatiles showed no inhibitory activity. The cytotoxicity tests against cell lines form breast cancer (MCF-7) and melanoma (A375), the oil with volatiles showed a LC50 of 1,64 ± 0,38 μg/mL and 1,28 ± 0,08 μg/mL, respectively. The oil without the volatiles didn’t show any cytotoxic activity to both cell lines, in the case of MCF-7 it even seemed to potentiate its growth. With this analysis, it can be noticed that the method to remove the volatiles from the oil resulted, on most cases, in a loss of biological activities associated with the oil with volatiles, this shows that most of the biological activities comes from the more volatile compounds of the oil. It was also studied the protein profile of the A375 cell line in contact with the oil with volatiles with native-PAGE and an increase of the expression of two proteins was verified, the POTE ankyrin domain family member F, which is associated with apoptosis and the HSP 90-β, which is overexpressed when the cell is in stress. Knowing this, it can be proposed that the A375 cells, in contact with the oil are being eliminated through apoptosis and are subject to cellular stress when in contact with the oil which can justify the high cytotoxicity. It was also studied, through Fourier transform infrared spectroscopy coupled with attenuated total reflectance (FTIR-ATR), the alterations in the structure of two model proteins, the bovine serum albumin (BSA) and lysozyme (Lys), in contact with the oil with volatiles and it was noticed that BSA didn’t suffer alterations in the studies made, although, the volatile compounds showed a capacity to protect the secondary structure of Lys which can prevent its aggregation. Concluding, this innovative study of the oil from the seeds of Nigella sativa was of extreme importance to identify the compounds in the oil that could be associated to the biological activities, complementing previous studies, and to understand the alterations of the proteins in human cell lines in contact with the oil, that can justify the bioactivity.
Descrição: Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2017
URI: http://hdl.handle.net/10451/30441
Designação: Tese de mestrado em Bioquímica (Bioquímica)
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