Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/30498
Título: Genetic deletion of adenosine A2a receptor in mice model of Alzheimer's disease: impact on synaptic plasticity
Autor: Peixoto, Ana Carolina Amaral
Orientador: Lopes, Luísa Maria Vaqueiro,1975-
Gomes, Rui Artur Paiva Loureiro,1958-
Palavras-chave: Doença de Alzheimer
Receptores A2A
Eletrofisiologia
APP/PS1
YHY-Tau22
Teses de mestrado - 2017
Data de Defesa: 2017
Resumo: A percentagem de população envelhecida a nível mundial está a aumentar consideravelmente. Com este aumento de população idosa, há também um aumento de doenças ligadas à idade avançada, tais como doenças cardiovasculares e neurodegenerativas. O envelhecimento é caracterizado pelo aumento de défices cognitivos assim como pelas alterações a nível da estrutura e funcionalidade do hipocampo, que apresenta um papel fundamental na memória. O envelhecimento e a doença de Alzheimer estão relacionados de forma direta, sendo que o envelhecimento é o maior fator de risco para a doença de Alzheimer. A doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa, sendo a forma de demência mais comum. É caracterizada pela presença de placas senis e novelos neurofibrilares. Atualmente, existem duas teorias que são globalmente aceites: a teoria da cascata β amiloide e a teoria da hiperfosforilação da proteína tau. De acordo com a teoria da cascata β amilóide, as placas senis são caracterizadas pela acumulação extracelular do péptido β amilóide (Aβ). Isto ocorre devido a falhas no processamento da proteína precursora amilóide (APP). Aβ é produzida nos indivíduos saudáveis. No entanto, sob certas circunstâncias, esta molécula agrega-se e leva ao desenvolvimento da doença de Alzheimer. Este processo ocorre quando duas enzimas proteolíticas atuam juntas, secretase-β e ϒ, reguladas por recetores acoplados à proteína G. Foram feitos vários estudos que suportam esta teoria nomeadamente estudos que mostram que a acumulação de Aβ é a causa primária da AD e que a progressão da doença, incluindo a formação de novelos de tau, é devida às alterações na Aβ. A maior objeção a esta teoria é que o número de depósitos de Aβ não é proporcional ao grau de défices cognitivos. Segundo a teoria da hiperfosforilação da proteína tau, os novelos neurofibrilares são formados devido à acumulação da proteína tau nos neurónios. Tau é uma proteína neuronal presente nos axónios e é essencial para a organização e dinâmica dos microtúbulos. Alterações na fosforilação desta proteína levam à sua agregação. Quando a proteína tau se torna hiperfosforilada, separa-se dos microtúbulos, agrega-se e forma os novelos de proteína tau. Existem vários modelos animais da DA que podem ser usados para estudar as duas teorias supramencionadas assim como alterações na transmissão sináptica e comportamentais. Os dois modelos de ratinhos usados neste trabalho foram: APP/PS1 e THY-Tau22. Ratinhos APP (apresentam APP sobre-expresso com mutação em um ou mais locais) foram cruzados com ratinhos PS1 (sobre-expressam o gene humano presenilina–PS1 que está envolvido no processamento da APP) a fim de obter ratinhos transgénicos APP/PS1 [7]. Ratinhos APP/PS1 apresentam um aumento de Aβ com os primeiros depósitos observados aos 5 meses. Este modelo animal é uma ferramenta fundamental para estudar o impacto da acumulação da proteína Aβ nos défices de memória. Ratinhos THY-Tau22 são um modelo animal para agregação da proteína tau presente na DA assim como em taupatias. Este modelo animal apresenta a proteína tau hiperfosforilada com progressão associada à idade: leve aos 3 meses e severa aos 7 meses. Este modelo é fundamental para estudar a correlação da presença da proteína tau com a DA. Adenosina é um neuromodulador muito importante responsável por diversos processos tanto a nível fisiológico como patológico. É uma molécula sinalizadora extracelular que influencia a transmissão sináptica. Quando esta molécula se liga a recetores acoplados a proteína G pode atuar a nível pré-sináptico (inibindo ou facilitando a libertação de neurotransmissores) ou a nível pós-sináptico (afetando a ação de recetores). Quando a molécula de adenosina se encontra na membrana celular pode ativar quatro subtipos de recetores acoplados à proteína-G: A1, A2A, A2B e A3; apresentando maior afinidade para os recetores A1, e A2A. Os receptores A1 são mais abundantes no cérebro, são responsáveis pela diminuição da libertação de glutamato tendo um papel de neuroprotecção. Os recetores A2A estão localizados nas sinapses, sendo considerados recetores excitatórios na medida em que facilitam a libertação de neurotransmissores. Durante o processo de envelhecimento há um aumento da expressão do recetor de Adenosina A2A (A2AR) nas zonas corticais, estando este associado ao aumento dos défices cognitivos. Os A2AR apresentam um papel importante para a presença de danos sinápticos e cognitivos presentes na população envelhecida e nos doentes de Alzheimer. O bloqueio destes receptores ou a sua deleção previne alguns dos fenótipos da doença de Alzheimer, nomeadamente défices na LTD, toxicidade sináptica e neuroinflamação, em modelos animais. A cafeína é a droga psicoativa mais usada no mundo sendo capaz de interagir com neurotransmissores em diferentes partes do cérebro e funcionando como um antagonista não específico dos receptores A2A. Dados epidemiológicos mostram que o consumo de cafeína atrasa o aparecimento de demência, reduz o risco de Alzheimer e atrasa o aparecimento de défices cognitivos em adultos de idade avançada. O hipocampo é uma estrutura localizada no cérebro humano responsável pela consolidação de memória e aprendizagem. Esta estrutura é considerada um bom exemplo de estudo da plasticidade neuronal através da potenciação de longa duração (LTP) e depressão de longa duração (LTD), que são fundamentais para aprendizagem e memória. A LTP consiste num aumento na transmissão sináptica e a LTD numa diminuição. Ambos são considerados como bons mecanismos de estudo do armazenamento de memória e podem ser induzidos artificialmente através de certos protocolos de estimulação eléctrica. Alterações na LTP e LTD no hipocampo foram descritos de estarem presentes em modelos de ratinho da doença de Alzheimer. O nosso objectivo com este trabalho foi comparar o impacto da deleção com o bloqueio farmacológico do receptor A2A nos modelos de Alzheimer (APP/PS1 e THY-Tau22) na potenciação de longa duração (LTP) e depressão de longa duração (LTD). Para isso, registamos potenciais excitatórios pós-sinápticos de campo (fEPSP) a partir da zona Schaffer collaterals – CA1 das fatias de hipocampo de dois grupos de animais transgénicos, modelos da doença de Alzheimer - APP/PS1 e THY-Tau22. No que diz respeito aos ratinhos APP/PS1, usamos 4 grupos diferentes de animais com 11-12 meses de idade que foram previamente submetidos a testes comportamentais. Os 4 grupos são: wild type (WT), A2A deletado (A2AR-/-), transgénico (APP/PS1) e transgénico com A2AR deletado (APP PS1/A2AR-/-). Induzimos LTP usando os protocolos de estímulos de alta frequência (HFS) (4 trains de 100Hz) e theta (TBS) (10 trains de 4 pulsos) e também a curva input/output (I/O) de forma a avaliar alterações na plasticidade sináptica. A partir dos resultados obtidos, conseguimos ver que em resposta ao estímulo TBS, o declive fEPSP era menor no grupo transgenico APP/PS1 comparativamente ao WT. Vimos também que este grupo, no que diz respeito à I/O, apresentou também um défice apresentando um declive da fEPSP menor para a mesma intensidade de estímulo. Não observámos nenhum efeito de reversão significativo da deleção dos A2AR nas respostas anteriormente mencionadas. Para além da LTP foi também induzida LTD usando estímulos de baixa frequência (3 trains de 1200 pulsos, 2Hz, 10 minutos de intervalo) de forma a estudar alterações na plasticidade sináptica. Conseguimos observar que ratinhos APP/PS1 apresentam alterações no declive da fEPSP, apresentando potenciação quando induzidos por estímulos de baixa frequência. Sob este estímulo, tanto o antagonista específico dos A2AR (SCH-58261) como a deleção dos A2AR reverteram a potenciação observada nos ratinhos transgénicos. No entanto, quando foi usado o antagonista específico, este reverteu totalmente a potenciação, apresentando novamente uma depressão similar à observada nos ratinhos WT. No que diz respeito aos ratinhos transgénicos THY-Tau22, usámos um protocolo de indução de LTD (3 trains de 1200 pulsos, 2Hz, 10 minutos de intervalo). Verificou-se que estes ratinhos transgénicos apresentam uma potenciação quando induzidos por um estímulo de baixa frequência. Quando o antagonista específico SCH-58261 foi adicionado verificou-se que este reverteu a potenciação observada nos THY-Tau22. Em suma, ratinhos transgénicos APP/PS1 apresentaram uma diminuição na LTP, que está associada aos défices de memória observados nos pacientes de Alzheimer. No entanto a deleção do receptor A2AR não melhorou ou reverteu estes danos na LTP induzidos por estímulos de frequência theta especificamente. No que diz respeito à LTD, conseguimos verificar que tanto o bloqueio dos A2AR como a sua deleção reverte a alteração na transmissão sináptica observada neste modelo, sendo que o bloqueio foi mais eficiente. Quanto aos ratinhos THY-Tau22, podemos verificar que estes apresentam uma alteração na LTD e que esta é revertida totalmente quando adicionamos o antagonista específico SCH-58261. Estes resultados parecem sugerir que a LTD é mais sensível a alterações induzidas pelo receptor A2A presente na sinapse Schaffer collaterals – CA1 do hipocampo. Mais estudos são necessários para se perceber o mecanismo subjacente a estas alterações.
Aging is a process characterized by cognitive decline, structural and functional alterations in the hippocampus, being the main risk for Alzheimer’s disease (AD). During the aging process, there is an upsurge of adenosine A2A receptor (A2AR) expression in cortical areas which is associated to cognitive defects. A2AR are G-protein coupledreceptors that have an important role in the establishment of synaptic/cognitive impairments throughout ageing and in neurodegeneration, particularly in AD. Blockade of A2AR or genetic deletion prevents some of the AD phenotypes in animal models; namely LTD defects, synaptic toxicity or neuroinflammation. Our main goal was to compare genetic deletion and pharmacological blockade of A2A receptor as a driving force to Alzheimer’s disease, performing a knockout of A2AR in an APP/PS1 and blocking A2AR in THY-Tau22 transgenic AD mice model and to assess changes in synaptic plasticity and basal transmission. We recorded field excitatory postsynaptic potentials (fEPSP) from Schaffer collaterals - CA1 hippocampal synapse from the two AD mice model. Regarding APP/PS1 mice, we used 4 groups of mice previously subjected to cognitive testing: wild type (WT), A2A receptor knockout (A2AR-/-), APP/PS1 (APP/PS1) and APP/PS1 x A2A receptor KO (APP/PS1/A2AR -/-).We elicited LTP using theta burst stimulus (TBS) (10 trains of 4 pulses, 100Hz) and assessed input/output (I/O) response to evaluate changes in synaptic plasticity. We observed that in response to TBS, the fEPSP slope was decreased in APP/PS1 mice compared to WT. This group also showed a shift to the right in the I/O curve. We could not observe any significant effect of knocking-out A2AR in those responses. We also elicited LTD using a LFS protocol (3 trains of 1200 pulses, 2Hz, 10 minutes interval). We observed that APP/PS1 transgenic mice showed a LTD-to-LTP shift. When A2AR was deleted on APP/PS1 mice model, the potentiation observed was abolish, but LTD was not restored. However, when we applied the selective A2AR antagonist, SCH-58261, to the slices of APP/PS1 mice, LTD impairment observed was fully rescued. Concerning THY-Tau22 mice we elicited LTD (3 trains of 1200 pulses, 2Hz, 10 minutes interval). We observed that fEPSP slope was increased in THY-Tau22, showing a potentiation in response to a low frequency stimulus. When SCH-58261 (A2AR antagonist) was infused in the electrophysiology chamber, the LTD impairment was reverted. Altogether, APP PS1 transgenic mice show LTP impairments, which are correlated with memory changes, as observed in AD. However, the deletion of A2AR did not improve or reverse LTP induced by this particular stimulation protocol. THY-Tau22 transgenic mice show LTD impairment and SCH-58621 rescued LTD impairment in THY-Tau22 mice. Hence, the A2AR effects in CA3-CA1 synapse in the hippocampus are more significant in LTD which may give more clues to the molecular mechanism to be explored in the future.
Descrição: Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017
URI: http://hdl.handle.net/10451/30498
Designação: Mestrado em Biologia Molecular e Genética
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