Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/30529
Title: Analysis of DFNB1 locus in presbycusis
Author: Correia, Bárbara Isabel de Carvalho
Advisor: Caria, Maria Helena
Keywords: Presbiacusia
Estudos funcionais
locus DFNB1
Mutações em GJB2 e GJB6
Teses de mestrado - 2017
Defense Date: 2017
Abstract: Introdução: O ouvido é um órgão sensorial que tem como função a transmissão e a tradução de sons para o cérebro assegurando assim a audição essencial a uma comunicação oral eficaz. A surdez é considerada a deficiência sensorial mais comum na população humana, comprometendo a integração social do indivíduo afetado e envolve a perda total ou parcial da capacidade de um indivíduo detetar sons. Aproximadamente 1/1000 recém-nascidos apresentam surdez, bem como cerca de 1/3 dos indivíduos com idade superior a 65 anos. A surdez está descrita como sendo a terceira doença sensorial crónica do mundo, prevendo-se um aumento de 25% dos casos até ao ano de 2020. A surdez associada à idade ou presbiacusia é uma doença multifatorial, representando a sequela final de diversos fatores intrínsecos e extrínsecos, que atuam no ouvido interno ao longo da vida. Esta forma de surdez caracteriza-se por uma perda auditiva progressiva, que começa nas altas frequências e está descrita como afetando mais homens do que mulheres. Esta forma de perda auditiva é também referida como surdez social por estar na origem do isolamento social e mesmo depressão, observados em alguns idosos onde a perda auditiva é maior. As causas de surdez podem ser genéticas ou ambientais como a associada a situações de anoxia, a doenças infeciosas ou infeções crónicas no ouvido, ao uso de medicamentos ototóxicos, exposição ao ruído e envelhecimento, como já referido. O locus DFNB1 foi o primeiro a ser identificado na surdez autossómica recessiva, contendo dois genes vizinhos no cromossoma 13, GJB2 e GJB6, que pertencem por isso ao mesmo cluster e que codificam individualmente duas proteínas transmembranares, a conexina 26 e a conexina 30, respetivamente. As conexinas são as subunidades dos conexões, estruturas que constituem as “gap-junctions” que funcionam como canais intercelulares. Ambas as conexinas, 26 e 30, são expressas na cóclea, entre as células ciliadas, pelo que possuem um papel fundamental no processo auditivo. Atualmente encontram-se descritas mais de 100 mutações e polimorfismos no gene GJB2. O espectro destas mutações varia entre populações, existindo mutações típicas das populações caucasianas, das asiáticas, etc, pelo que a identificação de mutações neste gene são muito relevantes em cada população. Duas grandes deleções no gene GJB6 são também responsáveis por casos de surdez. Dada a relevância dos genes GJB2 e GJB6 na etiologia da surdez em várias populações, o diagnóstico molecular de casos de surdez neurosensorial começa pelo seu estudo. Assim, faz sentido que na presbiacusia se estudem também estes genes procurando conhecer o seu efeito na causa deste tipo de surdez. Existem ainda mutações no gene GJB2 cuja patogenicidade é controversa, pelo que a realização de estudos funcionais que ajudem a clarificar o efeito destas mutações, identificadas de novo ou já conhecidas, é uma forma de prever a sua patogenicidade dessas mutações e assim estudar a sua associação com a surdez. A investigação com base em estudos genéticos e moleculares tem permitido grandes avanços na área da surdez, sugerindo que esta condição pode ser evitável e também pode ser tratada mais precocemente. Objetivo: O presente estudo teve como objetivo geral aumentar o conhecimento da surdez associada à idade em idosos da população portuguesa. Como objetivos específicos podem definir-se: 1) o papel dos genes GJB2/GJB6 na surdez associada à idade; 2) o estudo de novas mutações identificadas de novo na população Portuguesa com vista a clarificar a sua patogenicidade. Materiais e métodos: Foram analisadas 200 amostras de DNA, obtidas a partir de sangue colhido em idosos da população portuguesa, provenientes de diferentes regiões de Portugal. Todos os indivíduos assinaram um consentimento informado, responderam a um inquérito sobre o seu estado geral de saúde e antecedentes familiares, realizaram um audiograma com vista a identificar a presença de presbiacusia e aceitaram voluntariamente participar neste estudo pelo que também forneceram uma amostra de sangue colhida em cartão FTA. A pesquisa de mutações no gene GJB2 realizou-se em 80 amostras de DNA e em 120 amostras de DNA para o gene GJB6. Para isso foi amplificado por PCR e sequenciado em ambas as direções a região codificante (exão 2) do gene GJB2. As grandes deleções descritas no gene GJB6, foram estudadas por PCR multiplex, onde os primers usados permitem distinguir pelo padrão de amplificação a presença e a ausência das deleções. Foram estudadas três mutações p.Leu213X, p.Gly160Ser, p.Gly160Cys previamente identificadas de novo na população Portuguesa. Assim, realizaram-se culturas “in vitro” de células HeLa para efetuar estudos de expressão e de imunolocalização. Usaram-se também programas de modelação tridimensional de proteínas (CHIMERA, PYMOL e PDB) para tentar esboçar a conformação da proteína mutada comparativamente com a conexina selvagem (wild type) ou não mutada. Esta última abordagem foi também aplicada no estudo da mutação p.Ala40Gly identificada na amostra em estudo. Resultados e Discussão: Os 200 indivíduos considerados no presente estudo incluem 68.5% de mulheres (n=137) e 31.5% de homens (n=63), com idades compreendidas entre os 50 e os 90 anos de idade no geral. O estudo dos audiogramas mostrou que 4.5% (n=9) dos indivíduos apresenta uma audição normal (até 20dB de perda auditiva no melhor ouvido) e 16.5% (n=32) não possuem informação, pelo que os restantes 79% (n=159) apresentam presbiacusia. Destes, 1% dos indivíduos (n=2) apresentam surdez profunda (acima dos >81dB) sendo um homem com 70 anos de idade e uma mulher de 90 anos de idade. A pesquisa de mutações no gene GJB2 encontrou 5% dos indivíduos (n=4/80) com mutações em heterozigotia. Assim, nenhum deles apresentava surdez associada a GJB2 e todos estes indivíduos foram ouvintes durante toda a sua vida enquanto jovens e adultos. Observaram-se as mutações p.Arg143Gln (n=1) p.Met93Ile (n=1) e p.Ala40Gly (n=2) identificadas pela primeira vez na população Portuguesa. No gene GJB6 não foi observada nenhuma das grandes deleções já descritas. Os estudos realizados “in vitro”, em células HeLa que passaram a expressar a proteína conexina 26 (Cx26) selvagem (wt) e mutada com p.Leu213X, p.Gly160Ser ou com p.Gly160Cys, permitiam pela técnica Western Blot, verificar a expressão apenas da conexina 26 wt não tendo sido possível quantificar os níveis de expressão da conexina mutada com nenhuma das três mutações dado que não se observaram as bandas correspondentes. A repetição destes resultados sugere a não expressão das Cx26. Os resultados de imunofluorescência na presença da mutação p.Leu213X, evidenciam uma marcação perinuclear, enquanto que tanto com a mutação p.Gly160Ser como com a mutação p.Gly160Cys se observa uma marcação mais forte no núcleo, estes dados de alguma forma apoiam os dados obtidos com o Western Blot, mas, nos controlos não foi possível observar a imunomarcação da Cx26. Da análise comparativa da hipotética sequência tridimensional da Cx26 wt com cada uma das sequências referentes às quatro mutações em estudo (p.Leu213X, p.Gly160Ser, p.Gly160Cys e p.Ala40Gly), observaram-se diferenças entre os modelos obtidos para as 4 mutações. Estes resultados parecem sugerir a patogenicidade das mutações estudadas, já que as diferenças observadas poderão levar a alterações na função da proteína expressa o que justificaria os resultados obtidos nos estudos funcionais. Conclusões: Em termos epidemiológicos, as principais conclusões deste estudo permitem indicar que na sua maioria: 1) os idosos portugueses apresentam presbiacusia (79% dos casos da amostra), Quanto aos resultados genéticos resultantes do estudo do locus DFNB1 permitem concluir que: 1) apenas 5% dos indivíduos possuem mutações em GJB2 e nenhum em GJB6, pelo que o locus DFNB1 não parece estar associado à origem da presbiacusia ainda que esta amostra apresente uma incidência de portadores maior do que a população em geral; 2) As mutações p.Leu213X, p.Gly160Ser e p.Gly160Cys parecem ser patogénicas dado que não parecem expressar-se ao contrário da proteína wt, o que é suportado por não se ter conseguido as proteínas nas células HeLa e também porque se observam diferenças nas conformações da proteína normal e das proteínas mutadas nos modelos preliminares desenvolvidos; 3) a proteína p.Ala40Gly identificada em dois indivíduos desta amostra e de patogenicidade controversa segundo a bibliografia, poderá ser patogénica considerando as diferenças observadas nas hipotéticas conformações, mas não se realizaram estudos funcionais que apoiem este dado.
Introduction: The ear is a sensory organ which function is the transmission and translation of sounds to the brain. Hearing loss is a condition where a person loses part or all of their ability to hear sound. Age-related hearing loss or presbycusis is a multifactorial illness resulting from years of intrinsic and extrinsic factors affecting the inner ear during a life time. Locus DFNB1 was the first to be identified in autosomal recessive hearing loss and contains two neighbouring genes in chromosome 13, GJB2 and GJB6, which belong to the same cluster and codify two transmembrane proteins, connexin 26 and connexin 30, respectively. Research based on genetic and molecular studies has allowed us to make huge advances in understanding hearing loss, suggesting that this condition could be avoided and treated early on. Objectives: Our specific objectives are to: 1) understand the role played by genes GJB2/GJB6 in age-related hearing loss; 2) study the new mutations that have been identified in the Portuguese population, to better understand their pathogenicity. Material and methods: Analysis of 200 DNA samples taken from the blood of elderly Portuguese volunteers. Research into the mutations was carried out on 80 samples of gene GJB2 and 120 samples of gene GJB6, amplified by PCR. Four mutations were studied: p.Leu213X, p.Gly160Ser p.Gly160Cys and p.Ala40Gly, identified in the Portuguese population. In vitro cultures of HeLa cells were performed for expression and immunolocalization studies and functional studies using 3-D protein modelling programmes. This latter approach was also applied in the study of the identified p.Ala40Gly mutation in the study sample. Results and discussion: The group of 200 people has 68.5% women (n=137) and 31.5% men (n=63) between 50 and 90 years of age. The research into the mutations in gene GJB2 found that 5% of people had a heterozygote mutation. Three mutations, p.Arg143Gln, p.Ala40Gly and p.Met93Ile, were identified for the first time in Portuguese people. Using Western Blot it was not possible to quantify the levels of expression in the mutated connexin with the three mutations. Using the immunofluorescence technique, the location of connexin 26 on the cellular membrane was not observed. In the comparative analysis of the structure of the wild Cx26 and the protein containing one of the four mutations under study, differences were seen in all four cases. The results suggest these mutations are pathogenic as the differences observed may explain alterations in the function of the protein expressed and so they may affect hearing loss. Conclusions: The main conclusions of this study, epidemiologically speaking show: 1) Portuguese elderly present presbycusis (79% dos cases).The genetic results of the studies of the DFNB1 locus allow to conclude that: 1) only 5% of individuals have GJB2 mutations and none present GJB6 mutations, so the locus DFNB1 does not seem to be an important factor in presbycusis, although a high level was found in a prevalent number of carriers of the mutations in GJB2, above that found in the population at large; 2) Mutations p.Leu213X, p.Gly160Ser and p.Gly160Cys seem to be pathogenic as they do not appear to be expressed in the cellular membranes of the cells nor is it possible to quantify their low level of expression in those cells. The differences observed in the conformations created point to this conclusion, when compared to a normal protein; 3) The Ala40Gly protein was identified in two individuals from a controversial pathogenicity sample.
Description: Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2017
URI: http://hdl.handle.net/10451/30529
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