Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/30537
Título: Targeting the glycation defenses as a protective strategy for Parkinson's disease
Autor: Gomes, Bárbara Alexandra Fernandes
Orientador: Miranda, Hugo Miguel Vicente,1982-
Caeiro, Filomena,1950-
Palavras-chave: Doença de Parkinson
Glicação
Agregação proteica
Terapêutica
Teses de mestrado - 2017
Data de Defesa: 2017
Resumo: O aumento da esperança média de vida tem-se traduzido no envelhecimento progressivo da população mundial e consequente aumento da incidência de doenças associadas ao envelhecimento, tais como as doenças neurodegenerativas de Alzheimer ou de Parkinson. A doença de Parkinson é a segunda doença neurodegenerativa mais comum, a seguir à doença de Alzheimer, e é caracterizada pela degeneração progressiva de neurónios dopaminérgicos na substantia nigra pars compacta. Uma das características mais comuns desta doença é a formação de corpos de Lewy, estruturas maioritariamente compostas por a-sinucleína agregada. A perda dos neurónios dopaminérgicos conduz à redução da produção de dopamina, um neurotransmissor essencial à sinalização do movimento voluntário. Tal facto é responsável por várias manifestações motoras apresentadas pelos doentes. Estas incluem tremores, bradicinesia e rigidez muscular. Os doentes de Parkinson também podem manifestar sintomas não motores como a psicose, depressão, hiposmia e cognição comprometida. A maioria dos casos de Parkinson tem origem desconhecida, sendo o envelhecimento o seu maior fator de risco. A diabetes tem vindo a ser sugerida como um fator de risco importante para o aparecimento/desenvolvimento desta doença. Nomeadamente, cerca de 80% dos doentes de Parkinson apresentam intolerância à glucose; proteínas modificadas por açúcares nos seus cérebros; e falhas nas defesas contra os açucares. A hiperglicemia, consequência da diabetes, promove o aumento dos níveis de açúcares redutores no cérebro, tais como o metilglioxal. Este composto é um metabolito secundário, proveniente de diferentes vias metabólicas e, como outros açúcares redutores, pode reagir com proteínas numa reação denominada de glicação. A glicação é um processo que compreende uma série de reações entre açúcares redutores e grupos amina de proteínas, lípidos ou nucleótidos. Quando em reação com proteínas, formam como produto final os denominados produtos avançados de glicação (do inglês advanced glycation endproducts – AGEs). A glicação pode promover diversas alterações a diferentes níveis celulares, tais como disfunção mitocondrial, alteração de degradação proteica, ou até promoção de processos de inflamação. No contexto de modelos de Parkinson, verificou-se que a glicação induz o aumento da agregação e da toxicidade da a-sinucleína, provocando efeitos negativos em diversos processos celulares. Em particular, a glicação da a-sinucleína induzida pelo metilglioxal, altera o seu clearance, e afeta o proteossoma, macro-autofagia e também a secreção, levando à sua acumulação. A glicação pelo metilglioxal conduz também à perda de neurónios dopaminérgicos na substantia nigra e no estriado em ratinhos, modelos da doença de Parkinson. Enquanto que a formação do metilglioxal é inevitável, este pode ser catabolizado por diferentes vias, sendo o sistema dos glioxalases um dos mais eficientes. Para além de processos enzimáticos, existem também compostos capazes de sequestrar metilglioxal e impedir que este reaja com as proteínas. Existem também compostos que inibem o processo de glicação, ou que têm capacidade de remover os AGEs das proteínas. Assim, coloca-se por hipótese que os compostos que previnam a glicação possam ser benéficos na prevenção ou tratamento da agregação e citotoxicidade da a-sinucleína. Tendo em conta que o metilglioxal assume um papel importante na doença de Parkinson, neste estudo foi avaliado o potencial terapêutico de diversos compostos supressores de glicação tais como a metformina, pioglitazona, sulforafane, resveratrol, carnosina e aminoguanidina. A atividade destes compostos foi avaliada pela sua capacidade em proteger dos efeitos deletérios induzidos pela glicação. Nomeadamente, em reduzir a citotoxicidade da a-sinucleína/metilglioxal; os níveis de a-sinucleína; a agregação de a-sinucleína; os níveis gerais de AGEs; bem como de potenciar o clearance de asinucleína. O potencial de proteção foi avaliado de forma preventiva (antes do insulto) ou restaurativa (após insulto com metilglioxal). Para este efeito, foi utilizado como modelo de estudo células H4 (neuroglioma) a sobre-expressar a-sinucleína. Os compostos a avaliar foram incubados na ausência e/ou presença metilglioxal. A citotoxicidade foi avaliada pela perda de integridade da membrana citoplasmática, medida pela actividade do enzima lactato desidrogenase libertado. Os níveis de asinucleína foram avaliados por Western blot. A solubilidade de proteínas em Triton X-100 permitiu estudar a solubilidade da a-sinucleína proveniente de um extrato nativo de células que expressam SynT, uma variante da a-sinucleína com maior tendência para agregar. Na presença deste detergente, as proteínas mais solúveis, após uma centrifugação a alta velocidade por um período longo de tempo, permanecem na fração solúvel, enquanto que as insolúveis ficam precipitadas na base do tubo de centrifugação (fração insolúvel). À fração insolúvel correspondem proteínas agregadas. A agregação da a-sinucleína foi também avaliada por imunocitoquímica. Ao hibridar a a-sinucleína com um anticorpo secundário fluorescente, é possível, recorrendo a um microscópio de fluorescência, visualizar a presença de agregados intracelulares. O “clearance” da a-sinucleína foi estudado pela monitorização dos níveis desta proteína por western blot, de extratos proteicos de células cuja síntese proteica de novo foi inibida (pelo uso de cicloheximida) em diferentes momentos no decurso do tempo. Os resultados obtidos neste estudo revelaram que a metformina, a carnosina e a aminoguanidina, nas concentrações testadas, não apresentam citotoxicidade num contexto basal. O mesmo se verifica quando as células expressam a a-sinucleína e/ou quando a glicação é induzida pelo metilglioxal. A metformina, a carnosina e a aminoguanidina apresentaram capacidade de reduzir a citotoxicidade induzida pelo metilglioxal em células que sobre-expressam a a-sinucleína. Tal verificou-se num contexto preventivo bem como restaurativo. A metformina e a carnosina são igualmente capazes de prevenir o aumento dos níveis gerais de AGEs e de a-sinucleína/SynT, induzido pelo metilglioxal. No entanto, o mesmo não foi observado num contexto restaurativo, onde apenas a carnosina reduziu os níveis de AGEs em células que expressam a variante SynT, e por isso num contexto em que a agregação da a-sinucleína está potenciada. No que diz respeito ao perfil de solubilidade da a-sinucleína, a metformina solubilizou a proteína num contexto preventivo, o que sugere que tenha capacidade de prevenir a agregação da SynT. Por outro lado, a carnosina não parece modular a solubilidade da SynT. Num contexto restaurativo, nenhum dos compostos testados mostrou potencial para alterar a solubilidade da a-sinucleína. A agregação desta proteína foi também avaliada por imunocitoquímica. Uma vez que os compostos não apresentaram potencial restaurativo, a sua eficácia foi apenas avaliada num contexto preventivo. Os resultados preliminares revelam que tanto o tratamento com a metformina como com a carnosina resultam numa diminuição do número de células com agregados. Estes resultados estão em concordância com os observados nos testes de solubilidade. No que diz respeito ao clearance da a-sinucleína, os resultados preliminares sugerem que a metformina, não só previne contra os efeitos do metilglioxal (que impede o clearance da a-sinucleína) como potencia o clearance da a-sinucleína. Em suma, os resultados obtidos neste estudo sugerem que a metformina e a carnosina apresentam elevado potencial de proteção contra a citotoxicidade da a-sinucleína (30% e 20%, respetivamente), principalmente num contexto de glicação. A sua eficácia é maior num contexto preventivo, em modelos que apresentam maior agregação da proteína, bem como em condições de glicação induzida pelo metilglioxal. Em contexto preventivo, tanto a metformina como a carnosina diminuem os níveis gerais de glicação, o que está em concordância com o facto destes compostos serem sequestradores de metilglioxal. A carnosina também apresentou capacidade de reduzir os níveis de a-sinucleína ou SynT em células glicadas com metilglioxal. Ainda num contexto preventivo, tanto a metformina como a carnosina preveniram a agregação da SynT. A metformina apresenta ainda potencial para aumentar o clearance da a-sinucleína. É importante referir que no que diz respeito aos estudos de agregação (imunocitoquímica), bem como os de clearance da a-sinucleína, os resultados apresentados nesta tese são preliminares, e carecem por isso de confirmação com experiências adicionais. De futuro, pretende-se ainda testar o efeito da carnosina no clearance da a-sinucleína. Com este estudo conclui-se que a metformina e a carnosina são compostos com elevado potencial de proteção/prevenção contra os efeitos citotóxicos da a-sinucleína, particularmente em condições de glicação induzida pelo metilglioxal. Sugere-se, por isso, que estes compostos são potenciais fármacos para o tratamento da doença de Parkinson.
Parkinson’s disease is the second most common neurodegenerative disorder, characterized by the loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta, leading to several features of the disease such as abnormal motor performance and, at later stages, cognitive impairment. The main hallmark of this disease is the presence of Lewy bodies, which are primarily composed of a-synuclein. Diabetes has been associated as a risk factor for the development of Parkinson’s disease, and recently, glycation was suggested as the missing link between the two diseases. Reducing sugars, such as methylglyoxal, intervene in this reaction, leading to the formation of advance glycation end-products, which promote protein cross-linking. a-synuclein is an appealing target of glycation, since more than 10% of its residues are putative targets of this post-translational modification. Glycation is thought to play a key role in the aggregation of a-synuclein, as it promotes its aggregation and toxicity. As such, modulation of glycation defenses in Parkinson’s disease can represent a new therapeutic approach to delay or prevent the disease progression. This study aimed to evaluate the therapeutic potential of metformin, pioglitazone, sulforaphane, carnosine, and aminoguanidine, compounds already shown to protect against glycation toxic effects. To this purpose, the selected pharmacological compounds activity was tested, in a preventive or restorative paradigm, in cellular models of Parkinson’s disease under methylglyoxal-induced glycation. Regarding a-synuclein/methylglyoxal associated toxicity assessment, metformin and carnosine were the most active compounds. They were able to decrease toxicity both in a preventive and restorative manner. Moreover, these agents were also able to decrease the formation of advance glycation endproducts in cells treated with methylglyoxal. Carnosine, in a preventive manner, decreased a-synuclein protein levels. On the other hand, metformin is able to maintain a-synuclein (SynT) solubility. Preliminary data suggests that metformin not only decreases the number of cells with a-synuclein aggregates, but also promotes its clearance. In contrast, under a restorative paradigm, neither metformin nor carnosine modulate a-synuclein levels. In summary, metformin and carnosine have a protective potential against methylglyoxal-induced asynuclein glycation in a cellular model of Parkinson’s disease, making these a novel potential therapeutic approach to Parkinson’s disease.
Descrição: Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017
URI: http://hdl.handle.net/10451/30537
Designação: Mestrado em Biologia Molecular e Genética
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