Universidade de Lisboa Repositório da Universidade de Lisboa

Repositório da Universidade de Lisboa >
Faculdade de Ciências (FC) >
FC - Dissertações de Mestrado >

Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/3064

Título: Development of a new and rapid method to introduce heterologous DNA sequences into the Plasmodium genome
Autor: Pissarra, Joana da Silva, 1987-
Orientador: Khan, Shaihid M.
Zilhão, Rita Maria Pulido Garcia, 1959-
Palavras-chave: Biologia molecular
Malária
Plasmodium
Parasitas
Teses de mestrado - 2010
Issue Date: 2010
Resumo: Malaria is one of the most important parasitic diseases nowadays with a reported 243 million cases each year and almost half of the world’s population at risk of contracting the disease. The development of new and more effective drugs as well as a prophylactic vaccine is imperative and even though, in the recent years, several advances have been made with some vaccine candidates there is still no vaccine available. Genome manipulation and reverse genetics constitute powerful tools that contributed to these advances. Together, these techniques allow a better understanding of parasite-host interactions as well as new insight into gene function and expression. With the help of cloning and transfection technologies we aim to develop the proposed Swift Knock-in Markerfree (SKIM) method, a more efficient way to knock-in and/or knock-out genes of interest that overcomes some of the limitations of previously described transfection technologies namely, the time needed to obtain transfectants, low transfection efficiencies and the recycling of the drug resistance markers. The technique is based on a motherline expressing a fused positive/negative selectable marker and, through homologous recombination by double crossover, a heterologous DNA sequence replaces the selectable marker cassette and parasites can be selected by negative selection. We tested the viability of the technique and optimized the negative selection of the parasites with a fluorescent construct – our results show that not only through the SKIM method successful integration is achieved but also the transfection efficiency is high – 93% efficiency with 4 consecutive days of negative selection. Also, we use the technique to express transmission-blocking antigens – P. falciparum and P. berghei P25 and P48/45 – in parallel to the traditional positive selection transfection, with which we were able to introduce most of the antigens.
A malária ou paludismo é actualmente uma das doenças parasitárias de maior impacto global com 243 milhões de casos reportados anualmente e com quase metade da população em risco de contrair a doença; é prevalente sobretudo em países em desenvolvimento, sendo que 85% dos casos reportados se encontram em África. Estima-se que haja cerca de 1 milhão de mortes por ano sobretudo em crianças com idade inferior a 5 anos, o que constitui um enorme fardo para as populações onde a malária é endémica. É uma doença causada por parasitas protozoários da espécie Plasmodium. Existem cinco espécies capazes de causar infecção no homem – P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae e P. knowlesi, inicialmente um parasita de primatas. P. falciparum é o patogéneo mais importante sendo responsável por um maior número de casos e complicações graves, nomeadamente malária cerebral e placentária. Os parasitas diferem nas características microscópicas, distribuição geográfica e alguns aspectos do quadro clínico, mas partilham o mesmo ciclo de vida. O parasita possui como hospedeiros o humano e os mosquitos do género Anopheles. De forma resumida, o parasita reproduz-se sexuamente e assexuadamente no interior do mosquito e este, durante a picada, injecta esporozoítos que migram até ao fígado onde se reproduzem assexuadamente sem causar sintomatologia (fase hepática); em seguida, os merozoítos libertam-se dos hepatócitos, entram na corrente sanguínea onde invadem os eritrócitos. Assim tem início a fase sanguínea e o quadro clínico associado à malária – febre alta e com periodicidade, hepatoesplenomegalia, mal-estar, cefaleias e suores. Quando o mosquito fêmea volta a alimentar-se de sangue humano ingere eritrócitos infectados e o ciclo de vida do parasita prossegue. É um ciclo de vida complexo que dificulta o controlo e eventual eliminação do parasita. Desde a descoberta do parasita já foram adquiridos conhecimentos significativos e desenvolvidos fármacos capazes de eliminar o parasita, no entanto, ainda não está disponível nenhuma vacina profiláctica, essencial ao objectivo de erradicação. Já existem alguns candidatos que alcançaram a fase de ensaios clínicos e outros continuam a surgir com a ajuda da biologia molecular e outros instrumentos de investigação. A ideia de produzir uma vacina whole-organism é promissora e o seu potencial já foi provado em 1967 com imunização com esporozoítos inactivados por irradiação. É possível também produzir parasitas geneticamente atenuados, capazes de parar o seu desenvolvimento na fase hepática ou sanguínea, estimulando o sistema imune e assim actuar como vacina. Actualmente, existe um interesse crescente em desenvolver vacinas transmission-blocking, que terão um papel preponderante na eliminação do parasita da malária, juntamente com outras medidas de prevenção, uma vez que neutralizam o parasita no interior do mosquito de modo a que o seu ciclo de vida termine nesta fase e o mosquito deixe de contribuir para a transmissão da doença. As técnicas de modificação genética disponíveis em Plasmodium como a transfecção, mutação aleatória e silenciamento de genes, que contribuíram para a aquisição de conhecimento ao nível da biologia e patogénese do parasita e sobre função de proteínas e expressão génica, são então também essenciais ao desenvolvimento de uma vacina profiláctica contra a malária. A transfecção permite introduzir ADN directamente no genoma e assim fazer o knock-in (expressão de transgenes) ou knock-out (disrupção) de genes. Estes sistemas de transfecção já foram desenvolvidos quer para o parasita humano P. falciparum quer para parasitas murinos (P. berghei, P. yoellii, P. chabaudi) que oferecem a vantagem de estudar interacções parasita-hospedeiro in vivo enquanto o parasita humano está limitado a cultura in vitro. Os sistemas de transfecção actuais envolvem a introdução de um marcador que atribui uma característica fenotípica específica ao parasita, passível de ser seleccionada – geralmente, resistência a drogas. Existem sistemas de selecção positiva, sendo o mais utilizado a resistência à pirimetamina com a introdução do gene dhfr-ts (dihidrofolato redutase-timidilato sintase) proveniente de P. falciparum, de P. berghei (o modelo murino) ou de Toxoplasma gondii (outro parasita Apicomplexa); e existem também sistemas de selecção negativa nos quais os parasitas são naturalmente resistentes à droga, mas com a introdução de genes como yfcu (que codifica a proteína de fusão yCD::yUPRT – uracilfosforibosiltransferase) ou timidina cinase os parasitas tornam-se susceptíveis a fármacos como a 5-fluorocitosina. Estes marcadores encontram-se num vector de ADN que, após transfecção, pode ser integrado no genoma por crossover simples ou duplo, ou permanecer epissomal. Estes marcadores são suficientes para estudos de expressão de transgenes ou de disrupção de genes mas se se desejar obter parasitas livres de marcador ou modificar, eliminar e/ou introduzir outros genes são necessários marcadores adicionais ou outras técnicas. A técnica proposta SKIM (Swift Knock-in Markerfree) baseia-se numa linha de parasitas que expressa um marcador de selecção positiva e negativa, isto é, um gene de fusão entre o gene dhfr humano e o gene yfcu, integrado no genoma num locus não-essencial ao parasita, como o 230p; esta linha de parasitas é positivamente seleccionada (com pirimetamina) e é utilizada em transfecções subsequentes para introduzir a cassette de expressão do gene de interesse. Constrói-se um vector que apenas contêm o gene de interesse com o respectivo promotor e as sequências de integração no locus não-essencial 230p, idênticas às usadas previamente para inserir os marcadores de selecção. Deste modo, por recombinação homóloga entre as sequências de integração, ocorre a substituição de uma cassette por outra – os parasitas que sofreram integração expressam o gene de interesse, e serão resistentes à selecção negativa; os parasitas não transfectados, ainda com o marcador de selecção negativa, não sobreviverão ao tratamento. Assim, obtemos uma linha pura de parasitas transgénicos livre de marcador de selecção que pode ser sujeita a modificações genómicas adicionais. Esta técnica permite a utilização de qualquer locus para integração desde que as sequências de integração utilizadas sejam idênticas quer para o vector do marcador de selecção positiva e negativa quer para o vector que contém o gene de interesse. Este novo método baseia-se no facto de a integração em Plasmodium ser quase exclusivamente por recombinação homóloga que, aliada à selecção positiva e selecção negativa, oferece várias vantagens em relação a técnicas estabelecidas previamente nomeadamente: uma maior facilidade na realização de ensaios de complementação ou de introdução de transgenes, uma redução no tempo para obter parasitas integrantes e uma maior simplicidade de construção dos vectores, vectores estes de menores dimensões e que, por não terem marcador de selecção, não se mantêm epissomais. Após a construção da linha original que expressa o marcador de selecção positiva e negativa, integrado no locus 230p (1596cl1), testou-se a técnica com vectores de fluorescência (mCherry) e testou-se a eficiência de transfecção em experiências independentes que variam quanto à administração de 5-fluorocitosina, o fármaco de selecção negativa. Por análise microscópica e por PCR (Polymerase chain reaction) confirmou-se a correcta integração da cassette de fluorescência e, por análise de citometria de fluxo, observou-se uma eficiência de transfecção de 93% para a linha 1645, sujeita a 4 dias consecutivos de selecção negativa. Para além do desenvolvimento e optimização da técnica proposta, um dos objectivos é também a expressão dos antigénios transmission-blocking P25 e P48/45 de P. berghei e P. falciparum sob o controlo dos promotores ef1αa que assegura a expressão dos antigénios durante todo o ciclo de vida do parasita, e CS (promotor do gene que codifica a circumsporozoite protein) responsável pela expressão génica no esporozoíto e em todas as formas de diferenciação do parasita, na fase sexuada no interior do mosquito. Utilizou-se a transfecção por selecção positiva (vectores com as cassettes do gene de interesse e do marcador de selecção positiva TgDHFR) e a transfecção utilizando o método SKIM (vectores apenas com a cassette do gene de interesse introduzidos na linha de parasitas que expressa o marcador de selecção positiva e negativa) para a expressão dos antigénios seleccionados. Através da transfecção por selecção positiva podemos obter informações em relação à expressão e localização dos antigénios introduzidos. Após confirmação da correcta integração, por PCR e FIGE (Field-inversion Gel Electrophoresis), algumas linhas foram clonadas de modo a obter uma linha pura de parasitas. Algumas das linhas obtidas foram ainda analisadas por Southern blot, Western blot e Northern blot que revelaram uma correcta integração, expressão e transcrição, respectivamente, dos genes introduzidos. Apesar do sucesso da transfecção com os vectores de fluorescência, pelo método SKIM, não foi detectada por PCR e FIGE, uma correcta integração da cassette de genes transmission-blocking de interesse nas duas linhas criadas, possivelmente devido à incorrecta administração da 5-fluorocitosina. Em conclusão, os resultados preliminares indicam que é uma técnica com elevado potencial de aplicação revelando um menor tempo necessário à obtenção de linhas puras de parasitas transfectados, livres de marcador de selecção bem como uma elevada eficiência de transfecção. No entanto, como sugerido pelas linhas onde a integração não foi bem sucedida, é necessário optimizar as condições de selecção negativa de modo a garantir a eficiência do método. Como objectivos futuros, pretendemos analisar a expressão e localização dos antigénios introduzidos bem como realizar ensaios de imunogenicidade.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010
URI: http://hdl.handle.net/10451/3064
Appears in Collections:FC - Dissertações de Mestrado

Files in This Item:

File Description SizeFormat
ulfc090593_tm_Joana_Pissarra.pdf2,33 MBAdobe PDFView/Open
Restrict Access. You can request a copy!
Statistics
FacebookTwitterDeliciousLinkedInDiggGoogle BookmarksMySpaceOrkut
Formato BibTex mendeley Endnote Logotipo do DeGóis 

Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.

 

  © Universidade de Lisboa / SIBUL
Alameda da Universidade | Cidade Universitária | 1649-004 Lisboa | Portugal
Tel. +351 217967624 | Fax +351 217933624 | repositorio@reitoria.ul.pt - Feedback - Statistics
DeGóis
  Estamos no RCAAP Governo Português separator Ministério da Educação e Ciência   Fundação para a Ciência e a Tecnologia

Financiado por:

POS_C UE