Reprogramming the immune system with anti-CD4 monoclonal antibodies

Abstract

Immune tolerance is a state where the immune system does not respond aggressively towards a set of antigens while remaining fully competent to mount protective responses. The immune system is usually tolerant to our own antigens (self), to food antigens (oral tolerance), and to several other foreign substances to which we are regularly exposed (such as pollens and other potential allergens). Nevertheless, under certain conditions (genetic or environmental) there is a breakdown of tolerance to certain antigens, thus originating the onset of autoimmune and allergic pathologies. Regulatory T cells (Tregs) are central players in the maintenance of peripheral tolerance, having an essential role in preventing autoimmunity, as well as hypersensitivity reactions. However, the molecular mechanisms which mediate suppression are still obscure, and their investigation is a current priority, as it may reveal important targets for immune intervention. Studies in mouse models show that monoclonal antibodies (mAbs) targeting key lymphocyte molecules are able to produce long‐term tolerance following a shortterm therapy. This concept became known as immune reprogramming or therapeutic tolerance induction. Non‐depleting anti‐CD4 mAb have been shown to induce long term tolerance in transplantation through induction of Treg cells. Here I describe my research on the impact of non‐depleting anti‐CD4 mAb in different immune‐mediated pathologies aiming to reprogram the immune system towards tolerance induction. Furthermore, I studied the cellular and molecular mechanisms that mediate tolerance induction. The first step in this study was to assess tolerance induction in murine models of autoimmune diseases, where self‐tolerance is broken. We took advantage of well established animal models of rheumatoid arthritis (RA) and multiple sclerosis (MS), which are known to be mediated by Th1 and Th17 cells, thus indicating CD4 would be an optimal therapeutic target. Treatment with anti‐CD4 was successful in both models, being able to prevent the onset of the disease, and impairing disease progression. We found the mechanism characterizing anti‐CD4 effect relies on resetting the balance between effector and Treg cells towards a tolerance‐favoring ratio. In autoimmune arthritis we found this effect to be especially evident locally at the site of inflammation (within the synovia), where Th17 effector cells are markedly reduced and the Treg frequency is increased in anti‐CD4 treated mice. The study of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) allowed us to track antigen‐specific T cells, and further study the impact of anti‐CD4 treatment on naïve and pre‐activated T cells. We found anti‐CD4 prevented the proliferation and differentiation of naïve T cells into effector cells producing pro‐inflammatory cytokines (such as IL‐17 and IFN‐γ), with a progressive accumulation of Treg cells at a later time that are important in maintaining long‐term protection from the disease. Furthermore, anti‐CD4 therapy targets pre‐activated T cells in a different way by committing effector T cells towards apoptosis, thus leading to a ratio between effector and regulatory cells that once again favors tolerance. Importantly, the reprogramming is specific for the antigens present at the time of anti‐CD4‐treatment, with tolerant mice remaining fully competent to mount protective immune responses, namely to eradicate viral infections. Having established the efficacy of anti‐CD4‐induced tolerance induction in Th1/Th17 mediated diseases, I wanted to evaluate the impact of anti‐CD4‐treatment in a stringent model of Th2‐induced pathology, studying whether the mAb treatment could prevent peanut‐induced anaphylaxis in C3H/HeJ mice. Treatment with anti‐CD4 at the time of exposure to peanut antigens led to long‐term protection from further sensitization with peanut‐antigens and the development of anaphylaxis. Such long‐term tolerance was antigen specific as mice remained competent to respond to different antigens, namely by producing Th2‐mediated responses leading to IgE production. We found that long‐term tolerance appeared to be dependent on Treg cells: not only anti‐CD4 treated mice exhibited an increased frequency of Foxp3+ Tregs, but also CD25 depletion at the time of anti‐CD4 treatment abrogated tolerance induction. Taken together the results presented in this thesis suggest CD4 is a promising therapeutic target for the treatment of immune‐mediated pathologies, as different as autoimmune and allergic diseases.

A tolerância imunitária é o estado em que o sistema imunitário não responde agressivamente contra um determinado conjunto de antigénios, permanecendo competente para proteger o organismo de invasores patogénicos. Geralmente, o sistema imunitário é tolerante aos nossos próprios antigénios (auto‐antigénios), a antigénios alimentares (tolerância oral) e a muitas outras substâncias externas às quais estamos regularmente expostos (por exemplo pollens e outros potenciais alergénios). No entanto, sob determinadas condições (ambientais ou genéticas) pode haver uma quebra desse estado de tolerância a determinados antigénios, originando patologias como doenças autoimunes ou alérgicas. As células T reguladoras (Tregs) são elementos fulcrais na manutenção da tolerância periférica, desempenhando um papel crucial na prevenção de reacções autoimunes, bem como respostas de hipersensibilidade. Os mecanismos moleculares que caracterizam a supressão mediada por Tregs são ainda pouco claros, e a investigação dos mesmos é uma prioridade, pois pode revelar alvos importantes para intervenção terapêutica. Estudos em ratinhos revelaram que a utilização de anticorpos monoclonais, dirigidos para moléculas chave expressas em linfócitos, levaram à indução de tolerância a longo prazo, após um período terapêutico reduzido. Este conceito ficou conhecido como reprogramação do sistema imunitário ou indução de tolerância terapêutica. Estudos em transplantação demonstraram que o anticorpo não depletante anti‐CD4 leva a tolerância a longo prazo, através da indução de Tregs. Aqui descrevo a minha investigação sobre o impacto de anti‐CD4 como terapêutica em diferentes doenças imuno‐mediadas, com o objectivo de reprogramar o sistema imunitário induzindo tolerância. Primeiro, estudei a indução de tolerância em modelos de animais de doenças autoimunes, onde a tolerância a auto‐antigénios foi de alguma forma afectada. Aproveitámos a existência de modelos animais bem estabelecidos, tanto de artrite autoimmune como de esclerose múltipla, que se sabem ser mediados por células Th1 e Th17, e portanto fazem do CD4 um bom alvo terapêutico. O tratamento com anti‐CD4 foi bem sucedido em ambos os modelos, prevenindo o desenvolvimento de ambas as doenças, e impedindo a progressão das mesmas quando estabelecidas. Investigámos o mecanismo que caracterizava a protecção por anti‐CD4, e percebemos que este baseia‐se maioritariamente em re‐estabelecer o equilíbrio entre as células efectoras e as células reguladoras, favorecendo a tolerância. Em artrite autoimune este efeito verificou‐se a nível local, na zona de inflamação (sinóvia), onde as células Th17 estavam claramente reduzidas, enquanto as Tregs eram significativamente superiores àquelas dos animais tratados. O estudo de encefalomielite autoimune experimental (EAE) permitiu‐nos localizar as células T específicas para o antigénio, e consequentemente estudar o impacto do anti‐CD4 em células naïve e pré‐activadas. O anti‐CD4 inibiu a proliferação e diferenciação das células T naïve para células efectoras produtoras de citocinas proinflamatórias (como IL‐17 e IFN‐γ), com uma acumulação progressiva de células T reguladoras a longo prazo, que demonstrámos ser importantes na manutenção da tolerância adquirida. Além disso, a terapia com anti‐CD4 afecta as células pré‐activadas de forma diferente, induzindo a apoptose das mesmas, mais uma vez favorecendo o raio de células efectoras/células reguladoras no sentido da tolerância. De relevância, a tolerância induzida é específica para o antigénio presente na fase do tratamento, permitindo aos animais tolerantes permanecerem competentes para desenvolver uma resposta protectora contra um antigénio diferente, como no caso da resolução de uma infecção viral. Uma vez estabelecida a eficácia da tolerância induzida pelo anti‐CD4 em doenças mediadas por células Th1 e Th17, avaliei o impacto desta mesma terapia num modelo de doença grave mediado por células Th2. Para isto, utilizámos um modelo animal bem estabelecido de choque anafilático induzido por amendoins, em ratinhos C3H/HeJ. O tratamento com anti‐CD4 durante a fase de exposição a extracto de amendoim induziu a protecção perante nova sensibilização a amendoim, inibindo o desenvolvimento de manifestações de doença anafilática. Esta protecção revelou‐se mais uma vez específica para o antigénio em questão, permitindo que o sistema imunitário respondesse normalmente na presença de um antigénio diferente, inclusivamente, através da produção de IgE e citocinas do tipo Th2. A tolerância induzida pareceu ser dependente de Tregs, uma vez que os animais tratados com anti‐CD4 exibiram níveis significativamente elevados de Foxp3, e aquando da deplecção de células CD25+ durante o tratamento com anti‐CD4, não foi possível induzir o estado de tolerância. Em conclusão, os resultados obtidos nesta tese sugerem que anticorpos monoclonais anti‐CD4 têm um potencial terapêutico abrangente, para tratamento de patologias mediadas pelos diferentes subtipos de células T CD4, sejam doenças autoimunes ou alérgicas