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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/3117

Title: Identification and expression analysis of genes putatively involved in pathogenicity of Hemileia vastatrix to Coffea Arabica
Authors: Vieira, Ana Cristina Magalhães, 1987-
Advisor: Paulo, Octávio, 1963-
Keywords: Indústria do café
Pragas
Cultura do café
Biologia molecular
Expressão génica
Teses de mestrado - 2010
Issue Date: 2010
Abstract: O café é considerado o segundo produto mais importante no mercado internacional a seguir ao petróleo, representando uma importante fonte de receitas e divisas para mais de 60 países cafeicultores, muitos dos quais classificados como países em desenvolvimento. A sua importância a nível económico e social é inquestionável, visto que centenas de milhões de pessoas dependem, directa ou indirectamente, da sua indústria (cultura, processamento, comercialização, entre outros) para sobreviver. Actualmente, o mercado do café é considerado rentável e encontra-se em crescimento. Porém, pequenas perdas na produção e qualidade deste produto, como aquelas causadas por agentes patogénicos, têm consequências socio-económicas nefastas para a maioria dos países cafeicultores. Em casos extremos, as populações destes países são mesmo privadas dos cuidados básicos (tais como alimentos, medicamentos) e vivem em condições de vida bastante precárias. Deste modo, é vital implementar estratégias que visem o aumento da produtividade/qualidade do café no mercado internacional e, ao mesmo tempo, protejam a sua cultura de doenças epidémicas. Actualmente, várias destas doenças atacam o cafeeiro, sendo de destacar a ferrugem alaranjada, causada por Hemileia vastatrix Berkley and Broome, e a antracnose dos frutos verdes, causada por Colletotrichum kahawae Waller and Bridge pela sua importância económica. A ferrugem alaranjada afecta países cafeicultores por todo o mundo, gerando perdas de 30% se nenhuma medida de controlo for aplicada. Por outro lado, a antracnose dos frutos verdes encontra-se confinada ao continente Africano mas pode gerar perdas de produção mais severas, de até 80%. Neste trabalho, será apenas abordada a problemática da ferrugem alaranjada. H. vastatrix é um fungo biotrófico que depende das células vivas do hospedeiro para completar o seu ciclo de vida. A biotrofia caracteriza-se por um elevado grau de especialização por parte do agente patogénico, uma limitada actividade secretora, a formação de um interface rico em hidratos de carbono e proteínas entre as membranas celulares do fungo e da planta, a supressão das defesas da planta e a indução de genes do hospedeiro específicos para o estabelecimento da biotrofia, bem como a diferenciação de haustórios. Os haustórios são hifas especializadas, responsáveis não só pela nutrição do fungo, mas também pela emissão/recepção de sinais entre a planta e o agente patogénico. A necessidade de compreender toda esta dinâmica levou à realização de vários estudos moleculares e bioquímicos em diferentes organismos biotróficos tais como Cronartium quercuum, Melampsora lini, M. larici-populina, Phakopsora pachyrhizi, Uromyces fabae, U. vignae, e Puccinia spp. Contudo, até à data nenhum estudo semelhante foi realizado em H. vastatrix. O principal objectivo deste trabalho foi a identificação e análise da expressão de diversos genes potencialmente envolvidos no estabelecimento e manutenção da complexa interacção H. vastatrix – C. arabica. Para atingir este objectivo, foi ainda efectuada uma validação prévia de genes de referência que possam ser utilizados na normalização dos dados de expressão génica, os quais poderão constituir uma base para estudos análogos em H. vastatrix. Actualmente várias técnicas podem ser utilizadas na quantificação da expressão génica. O PCR quantitativo em Tempo Real é a técnica de excelência nesta área, devido à sua simplicidade, sensibilidade e eficiência. No entanto, para que os valores de expressão sejam fidedignos e se possam realizar inferências dos resultados com segurança, é essencial uma correcta normalização dos genes de estudo. Antes de aplicar esta técnica, é preciso atender ao facto que H. vastatrix é um organismo biológico complexo, com certas particularidades, tais como a impossibilidade de crescer em cultura artificial (in vitro), o que pode dificultar muito uma correcta validação dos genes de referência. Por isso, foi necessário aplicar um passo adicional de normalização que permitisse estimar a quantidade do fungo presente nas folhas, durante o processo de infecção. O perfil de expressão de oito genes, descritos na literatura como genes de referência, foi analisado e a sua estabilidade determinada, com recurso a programas informáticos de vanguarda (GeNorm e NormFinder), em três conjuntos de dados distintos: in vitro (uredosporos germinados e apressórios); in planta (estruturas de infecção pós penetração); in vitro+ in planta (conjunto de todas as amostras). Apesar dos dois programas terem apresentado os mesmos resultados para cada conjunto de dados (in vitro, in planta, in vitro+ in planta), a combinação de genes mais estáveis diferia entre cada um deles. Assim, Cyt b, 40S_Rib e Hv00099 foram os genes mais estáveis para as amostras in vitro, enquanto 40S_Rib, GADPH e Cyt III foram os mais estáveis para as amostras in planta. Para o conjunto das amostras (in vitro+in planta) os genes mais estáveis foram 40S_Rib, GADPH e Hv00099. Apesar destas diferenças, quando a expressão da proteína Gα foi analisada utilizando os factores de normalização específicos ou o factor de normalização global (o mesmo para todas as amostras), foi obtido um perfil génico semelhante com apenas algumas diferenças pontuais. Concluiu-se assim que ambas as estratégias permitiram obter uma normalização adequada, estabelecendo-se assim um conjunto de genes de referência para os estudos subsequentes de expressão génica, que constituem o objectivo principal deste trabalho. O perfil génico de onze genes potencialmente envolvidos no estabelecimento e manutenção da biotrofia foi obtido e a sua função inferida com base em estudos funcionais realizados noutras ferrugens. De acordo com a literatura, estes genes estavam envolvidos nos seguintes processos: i) modificação da parede celular do fungo para que esta não possa ser reconhecido pela planta (quitina desacetilases-CH1 e CH2); ii) vias de sinalização (proteina Gα e proteínas cinase mitogenicamente activadas-MAPK); iii) transporte de aminoácidos (AAT1_2 e AAT3); iv) transporte e metabolismo de açúcares (manitol desidrogenase-MADp1, transportador de hexose-HXT1p e invertase-INV); v) interacção com a planta (proteína de ferrugem transferida-RTP1p). A grande maioria destes genes revelou um perfil de expressão muito semelhante ao previamente descrito para outros fungos patogénicos, como por exemplo U. fabae, embora diferenças inesperadas tenham sido observadas para a quitina desacetilase, cujo aumento de expressão nas fases finais de infecção nunca tinha sido observado. MAPK também apresenta um perfil de expressão diferente do observado em outras ferrugens, uma vez que apenas é activada após a invasão do hospedeiro e não durante a formação dos apressorios, como foi previamente descrito. Este resultado sugere que este gene possa estar especificamente envolvido no processo de estabelecimento e manutenção da biotrofia, no entanto estudos funcionais são necessários para uma melhor compreensão do verdadeiro papel desta enzima. Por outro lado, os genes envolvidos na nutrição do fungo, tanto no transporte de aminoácidos como no transporte e metabolismo de açúcares, têm um perfil de expressão semelhante ao de U. fabae, o que claramente sugere uma elevada conservação nos genes responsáveis pela nutrição do fungo, durante o processo de biotrofia. Finalmente, como esperado, a RTP1 só foi detectada nas folhas infectadas, o que claramente sugere que também em H. vastatrix esta enzima pode estar envolvida na manutenção da biotrofia. Os resultados apresentados neste trabalho permitiram pela primeira vez a quantificação relativa da biomassa de fungo presente nas folhas infectadas durante o processo de infecção. Visto que tal estratégia nunca foi aplicada, foi aberto um novo caminho para estudos de expressão não só em H. vastatrix, mas também para outros agentes patogénicos de plantas com as mesmas limitações e dificuldades. Adicionalmente, desvendamos pela primeira vez alguns aspectos do processo molecular envolvido na complexa interacção C. arabica - H. vastatrix. Este conhecimento poderá contribuir para o desenvolvimento de estratégias de controlo de doenças bastante mais eficazes do que as aplicadas actualmente.
Hemileia vastatrix, the causal agent of coffee leaf rust, is a biotrophic fungus with a worldwide distribution, causing serious social and economic problems in coffee growing countries. Expression studies may have a key role in unraveling the transcriptomics of this pathogen as well as its complex gene-for-gene-based interaction with the host. However, a proper normalization is required to obtain reliable results. In this way the expression stability of eight reference genes (GADPH, EF-1, β-Tubulin, Cyt III, Cyt b, Hv00099, Ubi, 40S_Rib) was analyzed and two strategies were defined as fit for normalization. The first part of this work allowed the correct validation of reference genes to H. vastatrix. In the second part of this work, the gene expression profile of eleven H. vastatrix genes were analyzed (CH1, CH2, Gα-protein, MAP Kinase, AAT1_2, AAT3, INV, HXT1p, MAD1p, Asp_AT and RTP1p) for being putatively involved in the establishment and maintenance of the biotrophy. The expression profile of chitin deacetylases (CH1 and CH2) and Gα-protein revealed that these enzymes are involved in the establishment of the biotrophy during the early stages of infection. However, up regulation of CH1 in late infection stages in H. vastatrix is unparalleled in other rusts. The MAP kinase gene was only activated after host invasion and not during appressoria formation, unlike its homologues in other fungi, suggesting that this gene could be specifically involved in the establishment of the biotrophy. Amino acid transporters (AAT1_2 and AAT3), Invertase (INV), Hexose transporter (HXT1p) and Manitol desidrogenase (MAD1p) present similar expression profiles to Uromyces fabae, suggesting a fairly conserved process among rust fungi. Finally, the RTP1p seems to be highly expressed in planta, but not in the in vitro phases, suggesting a similar function to U. fabae. Overall, our results have provided valuable insights at the molecular level to the current understanding of the biotrophic interaction between H. vastatrix – C. arabica.
Description: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010
URI: http://hdl.handle.net/10451/3117
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