Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/31489
Título: The role of Down syndrome cell adhesion molecule 1 for the bacterial microbiota of Tribolium castaneum
Autor: Silva, Luís Manuel Macedo da
Orientador: Kurtz, Joachim
Sucena, José Élio da Silva
Palavras-chave: Dscam
Tribolium castaneum
16S rRNA
Microbiota
Imunidade
Teses de mestrado - 2017
Data de Defesa: 2017
Resumo: Organismos multicelulares estabelecem diversos tipos de interações com microrganismos. Estas interações podem ser positivas, neutras ou negativas para o hospedeiro. As diferentes interações moldaram a evolução do sistema imunitário. Interações negativas levam a uma co-evolução parasita-hospedeiro. Os hospedeiros necessitam de apresentar mecanismos e respostas imunes mais eficientes para sobreviverem e reproduzirem-se, enquanto que os parasitas requerem novas formas de escapar ou resistir ao sistema imune do hospedeiro e infectá-lo. Contudo, grande parte dos organismos estabelecem interações neutras ou benéficas para o hospedeiro. Num cenário de mutualismo, a interação pode ser necessária ao desenvolvimento de estruturas ou crucial para que o hospedeiro apresente uma imunidade eficiente. No caso das interações neutras, pensa-se que sejam dinâmicas e facilmente possam evoluir para uma interação positiva/negativa. Desta forma, os diversos tipos de interação levaram à evolução do sistema imunitário e à necessidade de uma forma de diferenciação entre microrganismos benéficos e prejudiciais por parte do hospedeiro. Uma possível explicação para a diferenciação entre diferentes tipos de interação foi sugerida recentemente por Lazzaro and Rolff. Esta hipótese sugere que o sistema imunitário do hospedeiro é capaz de ajustar o tipo de resposta conforme o rácio de sinais a que é sujeito. Enquanto que uma ferida levaria à expressão de sinais de danos, um simbionte apenas apresentaria os seus padrões moleculares associados a micróbios a receptores nas células do hospedeiro. Contudo, um parasita apresentaria não só os padrões moleculares associados a micróbios, como também causaria danos no tecido infetado, levando à expressão de sinais de danos pelas células. Assim, o estabelecimento de interações positivas e respostas imunes apropriadas dependem do reconhecimento por parte do hospedeiro e possivelmente de um balanço entre diferentes sinais. A diferenciação entre diferentes microrganismos deverá depender de receptores que permitam o reconhecimento e levem à produção uma resposta adequada. Dscam1 tem sido sugerido como possível receptor de reconhecimento dada a grande quantidade de isoformas que é capaz de produzir por alternative splicing. Down syndrome cell adhesion molecule 1 (Dscam1) é um gene expresso em neurónios e em alguns invertebrados em células e tecidos do sistema imunitário. Por alternative splicing é capaz de originar cerca de 18.000 isoformas em Drosophila melanogaster e 15.000 em Tribolium castaneum. Esta proteína é essencial para o desenvolvimento de circuitos neuronais A grande variabilidade de isoformas permite a identificação e consequente repulsão de dendrites-irmãs. Isto assegura que as dendrites cubram a maior área possível e assim estabeleçam um correto circuito neuronal. A análise da estrutura proteica de Dscam1 permitiu identificar dois epítopos (I e II). O epítopo I está envolvido em interações homofílicas no sistema nervoso e é bastante conservado, coerente com a sua função no desenvolvimento de circuitos neuronais e elevada pressão seletiva para um grupo limitado de isoformas. Por outro lado, o epítopo II apresenta grande variabilidade na sua sequência. Dada esta variabilidade, foi proposto que este epítopo poderá estar envolvido no reconhecimento de microrganismos. Recentemente, vários estudos têm proposto não só uma função no reconhecimento de microrganismos, mas também como possível opsonina e/ou regulador de bactérias no hospedeiro. Sabe-se que diferentes bactérias induzem a expressão de diferentes isoformas de Dscam1. Contudo, ainda permanece um mistério como é que é produzida esta expressão diferencial e qual a sua função na imunidade de invertebrados. No mosquito Anopheles gambiae, um knock-down de Dscam1 levou a uma redução no index de fagocitose, bem como uma proliferação das bactérias na hemolinfa. Seis anos mais tarde, ao sobre-expressarem uma isoforma de Dscam1 induzida na presença de bactérias, observaram uma redução nas bactérias no mosquito. Porém, há resultados contraditórios. Em Laodelphax striatellus após o knock-down de Dscam1, observa-se uma redução na infeção por parasitas intracelulares como Wolbachia e nenhuma alteração no número de bactérias extracelulares. Deste modo, o objetivo desta tese foi clarificar o papel de Dscam1 na microbiota bacteriana de T. castaneum. Para tal, procedeu-se ao knock-down de Dscam1 e posteriores análises à quantidade total de microbiota bacteriana em três pontos de desenvolvimento: estádio de larva (15 dias pós-oviposição); estádio de pupa (23 dias pós-oviposição) e estádio de adulto (30 dias pós-oviposição). Através de RTqPCR foi possível quantificar quer o knock-down de Dscam1, quer a quantidade de bactérias em cada tratamento utilizando como proxy o gene bacteriano 16S rRNA. Os resultados deste projeto mostram que em Tribolium castaneum, um knock-down de Dscam1 parece não afetar a quantidade total de bactérias. Isto foi observado para os três pontos de desenvolvimento analisados. Estes resultados sugerem que neste modelo, Dscam1 poderá não regular a flora bacteriana como observado em mosquito. No entanto, foi observada uma forte correlação entre a expressão relativa do 16S rRNA bacteriano e a expressão relativa do Dscam1 para dois dos três pontos de desenvolvimento. A correlação é de caráter negativo: uma maior expressão de Dscam1 está correlacionada com uma menor expressão de 16S rRNA e por consequente, menor quantidade de bactérias no sistema. Esta tendência foi observada por Dong e colegas em mosquitos adultos. Assim, é possível que Dscam1 faça parte de um sistema robusto que reconhece/regula bactérias e não é afetado por baixos níveis de Dscam1. É ainda possível que caso Dscam1 tenha uma função no reconhecimento/regulação de bactérias, haja outros receptores com função redundante que possam compensar a falta deste em particular. De forma a responder a estas questões, um estudo mais exaustivo onde se analisasse também a composição bacteriana após knock-down de Dscam1 seria necessário. É possível que não se observe alterações na quantidade total de bactérias, mas sim diferentes proporções de cada classe após redução de Dscam1. Seria expectável que classes reguladas por Dscam1 teriam as suas proporções aumentadas face a outras classes. Dada a evidência de forte competição bacteriana dentro da microbiota, é possível que não se observe diferenças significativas no número total de bactérias, mas sim diferenças na sua identidade.
Hosts establish different types of interactions with the elements of their microbiota. These interactions can be broadly classified as positive, neutral or negative and shaped the evolution of the immune system. Negative interactions may lead to host-parasite coevolution. While the host may only survive and reproduce by exhibiting more efficient immune responses, the parasite requires novel ways of dodging the host's immune system. On the other hand, positive interactions can evolve to the point where the lack of specific microorganisms may interfere with tissue development, immunity or resistance to pathogens. Neutral interactions are not only difficult to define but are also thought to be dynamic and could evolve to either positive or negative interactions. Consequently, the host needs to be able to differentiate between harmful and beneficial microbes. This identification is thought to be performed through pattern recognition receptors that recognise microbe-associated molecular patterns and other environmental cues, enabling an appropriate response from the host. Dscam1 is a gene expressed in neurons and essential to the correct development of neuronal circuits. Through alternative splicing, it is able to originate around 18.000 isoforms in Drosophila melanogaster and 15.000 in Tribolium castaneum. More recently, its expression was observed in immune cells and tissues of some invertebrates. Recent studies have shown differential isoforms expression after infection by different classes of bacteria. Hence, it was suggested that Dscam1 may work as a pattern recognition receptor, opsonin and/or bacteria regulator. Concerning bacteria regulation, there are studies in Anopheles gambiae that show a proliferation of gut bacteria after a Dscam1 knock-down. In the same model, overexpression of bacteria-induced Dscam1 isoforms resulted in a reduction of bacteria in the haemolymph. The above-mentioned results suggest that Dscam1 is involved in negative regulation of bacteria. Nonetheless, there is also evidence suggesting a decrease in the intracellular parasites and no effect on extracellular bacteria after Dscam1 knock-down in Laodelphax striatellus. Hence, I aimed to clarify the role of Dscam1 in the dynamics of Tribolium castaneum bacterial microbiota. This was achieved through Dscam1 knock-down and bacterial load analysis through RTqPCR for the bacterial 16S rRNA at three time-points of the beetle development: 15-days old larvae, 23-days old pupae and 30-days old adults. Our results show that a Dscam1 knock-down does not affect the total amount of bacteria in the beetle in any of the three developmental time-points analysed. This is in agreement with previous studies. Nevertheless, a correlation between the relative expression of the bacterial 16S rRNA and Dscam1 was observed. The correlation had a negative tendency: a higher expression of Dscam1 was correlated with a lower expression of 16S rRNA and therefore less bacteria in the system. Such a tendency was also observed in Dong and colleagues’ studies on adult mosquitoes. A knock-down may not be sufficient to disturb a robust system capable of bacterial regulation in this model. Further analyses of the composition of bacterial microbiota are required to clarify the role of Dscam1 in bacterial regulation in T. castaneum. It is for example possible that changes occur in the proportion of different bacterial taxa.
Descrição: Tese de mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017
URI: http://hdl.handle.net/10451/31489
Designação: Mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento
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