Functional characterization of tumour-derived exosomes in the zebrafish xenograft model

Abstract

Os exossomas, são as vesículas extracelulares mais pequenas que se conhece, com diâmetros entre 30 e 150 nm, compostos por uma bicamada fosfolipídica que pode conter ácidos nucleicos, proteínas, enzimas, lípidos, citoquinas, entre outras moléculas, podendo portanto, representar em parte o genótipo e fenótipo das suas células de origem. Uma das principais funções dos exossomas é o seu papel como intermediários na comunicação célula-a-célula, suportando a progressão do cancro através da reprogramação do microambiente tumoral. Para tal, os exossomas desempenham diferentes papéis, incluindo modulação de permeabilidade vascular, educação de células estromais, assim como a ‘educação’ e recrutamento de células derivadas da medula óssea. Sabe-se que estas vesículas preparam um microambiente favorável em futuros locais metastáticos, antes da chegada das células tumorais, os chamados ‘nichos pré-metastáticos’. Além disso, estudos recentes demonstram que o padrão de biodistribuição de exossomas tumorais em modelos murinos está diretamente correlacionado com o local da formação de microambientes pró-metastáticos e, consequentemente, com o perfil de disseminação metastática dos tumores em questão. Sabe-se ainda que este padrão de biodistribuição, ou organotropismo, dos exossomas derivados de tumores pode ser explicado, em parte, pelo seu perfil de composição de integrinas membranares. Desta forma, argumenta-se que a caracterização dos exossomas em circulação pode servir de ferramenta para prever a propensão para doença metastática, assim como, determinar para que órgão a doença poderá metastizar no futuro. Por ser possível obter estes exossomas a partir de fluidos corporais, como o plasma sanguíneo, os exossomas têm potencial como fonte não invasiva para a obtenção de biomarcadores de cancro. Além de estudos de caracterização de conteúdo molecular, tendo em vista a grande complexidade das possíveis interações de exossomas tumorais com o organismo do hospedeiro, faz-se indispensável a aplicação de estudos in vivo, tais como os envolvendo roedores. Apesar de muito informativos, estes modelos requerem uma quantidade significativa de exossomas, dificultando e/ou impedindo a realização de ensaios in vivo a partir de fontes limitadas de exossomas, tal como plasma sanguíneo de doentes oncológicos. Tendo em conta a correlação direta entre a biodistribuição exossomal e o organotropismo tumoral, o desenvolvimento de ensaios in vivo que permitam identificar a biosdistribuição exossomal, são de grande importância para a caracterização do perfil das doenças oncológicas. Para tal, neste projeto propusemo-nos a testar a aplicabilidade de modelos de pequena escala, tal como o de peixe-zebra (Danio rerio), para estudos in vivo da atividade biológica de exossomas derivados de tumores. O peixe-zebra é um modelo já muito utilizado em investigação biomédica, apresentando uma grande semelhança genética aos humanos (70% de todos os genes associados a doenças humanas têm homólogos funcionais em peixe-zebra), sendo vários os sistemas e órgãos notavelmente semelhantes aos dos humanos. Além disso, a vasculatura embriónária e os genes e cascatas de sinalização moleculares que controlam a hematopoiese são altamente conservados entre peixes e mamíferos. A semelhança da hematopoiese entre peixe-zebra e mamíferos vai para além da conservação de genes, partilhando também todos os tipos de células sanguíneas que são geradas de células estaminais de linhagens em comum. Para além disto, o peixe-zebra apresenta vantagens técnicas e funcionais muito relevantes frente a modelos de roedores, tendo menor custo de manutenção do que os modelos murinos e permitindo um maior número de indivíduos por experiência. Além disso, a transparência dos peixes-zebra em fase larval permite a visualização não intrusiva de órgãos e processos biológicos in vivo, ao contrário dos modelos murinos adultos, nos quais tais aspectos só podem ser observados a partir de ensaios ex vivo. Para ser possível efetuar qualquer estudo com exossomas neste novo modelo, foi necessária a estandardização da dose de exossomas a injetar nas larvas de peixe-zebra. Neste sentido, isolámos e testámos diferentes doses de exossomas de algumas linhas de células tumorais murinas: cancro do pâncreas, parental e metastática (nomeadamente, PAN02 e PAN02-H3) e também de melanoma (B16-F10). Em ratinho, PAN02 e PAN02-H3 são altamente metastáticas para fígado e B16-F10 para os pulmões. Como controlo não tumoral, isolámos exossomas a partir da cultura de pâncreas de ratinhos saudáveis. O padrão é injetar 5 a 10 ug de proteína exossomal em ratinhos, os quais têm cerca de 25 g de massa corporal. Sendo a larva de peixe-zebra um modelo muito menor, com aproximadamente 1 mg de massa corporal, tentámos reduzir esta dose de injeção em pelo menos 1000 vezes, de microgramas para nanogramas. Testámos injetar doses num intervalo entre 0.5 a 50 ng, em larvas de peixe-zebra às 48 horas pós fertilização. Concluímos que a dose recomendável para ser possível visualizar sinal exossomal, sem este estar saturado, seria a dose de 5 ng por larva. Observámos que o sinal mais significativo de exossomas apresentou-se sempre na zona caudal das larvas, transversalmente a todos os tipos de exossomas injetados. Esta região é denominada por tecido hematopoiético caudal (caudal hematopoietic tissue, CHT), local transitório onde ocorre a hematopoiese na larva e o órgão análogo ao fígado fetal dos mamíferos. Por isso, neste trabalho, focámo-nos principalmente na análise do CHT, subdividindo esta região em dois quadrantes (Q), Q7 e Q8. No Q7 foi possível observar diferenças significativas no número de células que incorporaram exossomas, sendo este número maior nos exossomas PAN02 do que nos B16-F10. De forma a tentar estudar melhor o organotropismo destes exossomas, testámos também exossomas com biodistribuição semelhante a PAN02, derivados de cancro colorectal (CT26-FL3), altamente metastático para fígado. Além disso, testámos exossomas derivados de Lewis Lung Carcinoma (LLC), para comparar estes com os resultados dos B16-F10, ambos tumores altamente metastáticos para o pulmão. Nestas últimas experiências os resultados obtidos não apresentaram diferenças significativas na zona do CHT entre os diferentes tipos de exossomas tumorais injetados. No entanto, observámos, consistentemente, que a afinidade dos exossomas derivados de pâncreas saudáveis (Normal Pan) com os tecidos na região do CHT era mais reduzida do que todos os exossomas tumorais testados. Este resultado permitiu-nos concluir que a retenção dos exossomas naquele local não era exclusivamente mecânica e que existe algum tipo de interação entre os exossomas tumorais e o tecido hematopoiético caudal das larvas de peixe-zebra. Este padrão de biodistribuição relaciona-se com o que foi observado em ratinho, onde os exossomas têm um papel na comunicação entre as células tumorais e as células derivadas da medula óssea (bone marrow derived cells, BMDCs), as quais desempenham um papel preponderante para o desenvolvimento de fenótipos pró-metastáticos. Além disso, medimos no modelo de peixe-zebra a incorporação de exossomas por células mielóides, frequentemente envolvidas nos efeitos in vivo de exossomas tumorais, como os macrófagos. Através de resultados preliminares, pudemos observar que uma parte da população de células, cerca de 5-15%, que incorporaram exossomas eram células mielóides. Neste trabalho, testámos também diferentes doses de exossomas isolados a partir de plasma de pacientes de cancro de pâncreas, no modelo de peixe-zebra. A dose determinada anteriormente para exossomas isolados a partir de culturas celulares, 5 ng, não foi suficiente para obter um sinal exossomal. Desta forma, a dose teve de ser aumentada para 30 ng por individuo. Apesar da necessidade do aumento da dose em 6 vezes, esta ainda é mais de 166 vezes menor do que a utilizada em modelos murinos. Nos dados preliminares obtidos, não foi possível observar diferenças significativas entre exossomas do plasma do controlo saudável e do paciente estudado. Além do limitado número de indivíduos aqui avaliados, a elevada variabilidade da origem dos exossomas presentes no plasma, dificulta a análise dos exossomas derivados do tumor do paciente, já que cerca de 80% dos exossomas destas amostras são de origem não tumoral. A nossa hipótese é que a utilização do modelo animal de peixe-zebra, possa possibilitar a medição da atividade biológica de exossomas tumorais e auxiliar na localização e detecção precoce do risco de doença metastática em pacientes oncológicos. Além disso, acreditamos que este novo modelo experimental possa servir de complemento aos estudos feitos em modelos murinos, permitindo que se façam estudos utilizando uma quantidade de amostra exossomal significativamente menor por indivíduo.

It has been recently shown that the pattern of biodistribution of tumour-derived exosomes in murine models is directly related to the metastatic distribution profile of the same exosome-producing tumour cells. Although very informative, this model requires significant amounts of exosomes for complete in vivo experiments, which is an important limiting factor due to the small quantity of exosomes obtainable from each patient sample. In this work, we tested whether it is possible to use the zebrafish model for in vivo studies of the biological activity of tumour-derived exosomes, through the analysis of their biodistribution. We tested exosomes derived from several tumour cell lines, with different organotropisms and found that these exosomes have a special affinity for the caudal hematopoietic tissue (CHT) of the larvae, which parallels the mammalian bone marrow. Importantly, in mammal animal models, bone marrow cells play a major role in pro-metastatic phenotypes. This large accumulation in the CHT was not detected using exosomes from non-tumour cells, suggesting that this CHT affinity is not based on a mechanical phenomenon. Furthermore, we tested in the zebrafish model whether exosomes are taken up by myeloid cells, like the macrophages, which are frequently involved in the in vivo effects of exosomes and observed that ~15% of the cells that take-up exosomes are from this lineage. Finally, we were able to standardize the injection dose of exosomes derived from tumour cells and plasma of pancreatic cancer patients for in vivo zebrafish biodistribution assays. Our hypothesis is that the use of small scale models, like zebrafish, to perform in vivo studies, can enable the measurement of the biological activity of tumour-derived exosomes and help to localize and detect the risk of metastatic disease in oncologic patients early.