Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/31663
Title: Identification and characterization of new players involved in the centriole maintenance program
Author: Rodrigues, Patrícia dos Reis
Advisor: Marques, Ana Rita Pimenta
Pinto, Francisco
Keywords: Centrossoma
Drosophila melanogaster
Estabilidade centrossomal
RNAi screen
Ana1
Teses de mestrado - 2017
Defense Date: 2017
Abstract: O centrossoma é, em células animais, o principal centro organizador de microtúbulos (COMT). Em interfase regula a mobilidade, adesão e polaridade celulares, enquanto que em mitose participa na formação e organização do fuso mitótico. Cada centrossoma é composto por dois centríolos. Os centríolos são estruturas cilíndricas formadas por nove microtúbulos (organizados em singletos, dupletos ou tripletos) dispostos de forma radial em redor de uma estrutura central (a cartwheel). Um dos centríolos do par é denominado de centríolo-mãe, enquanto que o outro, ortogonalmente disposto em relação ao primeiro é denominado de centríolo-filho. Um centríolo tem aproximadamente 200nm de largura e pode possuir entre 200 a 500nm de comprimento, dependendo do tipo de célula. Em conjunto ambos os centríolos recrutam e participam na organização de uma matriz proteica densa - o material pericentriolar – que os rodeia e é responsável pela nucleação de microtúbulos. Finalmente, em fases específicas de diferenciação, os centríolos associam-se à membrana celular para formar a corpo basal, a partir do qual crescerá o cílio ou flagelo da célula. A simetria radial dos centríolos é extremamente conservada nos diferentes ramos da árvore filogenética, porém a estrutura centriolar pode variar ligeiramente de espécie para espécie. Em Humanos os centríolos são compostos por nove tripletos de microtúbulos, ao passo que os centríolos em Drosophila melanogaster são formados por nove dupletos de microtúbulos. Em algumas espécies os centríolos-mãe possuem apêndices distais e sub-distais que permitem a ligação do centríolo à membrana celular e a ancoragem de microtúbulos, respetivamente. O número de centríolos presente nas células é altamente controlado, e a sua duplicação é regulada tanto temporalmente - em coordenação com a replicação do DNA - como espacialmente - apenas um centríolo-filho se forma junto a cada centríolo-mãe por cada novo ciclo celular. Dependendo da fase do ciclo celular em que se encontra, a maioria das células tem um (fase G1) a dois centrossomas (fase S, G2 e M) (dois a quatro centríolos). Alterações no número de centríolos estão associadas a diversas doenças como o cancro, microcefalia ou ciliopatias. Diferentes estudos demonstram que os centrossomas são resistentes a tratamentos de despolimerização de microtúbulos. Consequentemente, estes organelos são descritos como estruturas altamente estáveis; no entanto, várias observações têm demonstrado que os centrossomas não são estruturas intrinsecamente estáveis como inicialmente se pensava. Em diversos sistemas celulares estes organelos podem ser eliminados ou inativados, como na gametogénese feminina ou em células diferenciadas, respetivamente. A eliminação de centrossomas durante a oogénese é comum na maioria dos metazoários, equinodermes e molúsculos. Porém, enquanto que no caso dos metazoários a eliminação dos centrossomas ocorre antes das divisões meióticas, em equinodermes e molúsculos estas estruturas só desaparecem durante as divisões meióticas. A eliminação dos centrossomas durante a gametogénese feminina implica que o embrião dependa do centríolo fornecido pelo esperma para que ocorram as primeiras divisões celulares no embrião, após a fertilização. A eliminação de centrossomas na oogénese é um processo biológico muito importante e o conhecimento dos mecanismos que o regulam é ainda muito escaço. Um estudo publicado recentemente pelo nosso grupo desvendou um mecanismo de regulação da eliminação de centrossomas durante a oogénese em Drosophila. Em Drosophila a oogénese inicia-se no germário com a divisão assimétrica de uma célula estaminal que dá origem a uma nova célula estaminal e um cistoblasto. O cistoblasto sofre quatro divisões consecutivas com citocinese incompleta formando um grande cisto composto por dezasseis células em que apenas uma dará origem ao oócito, sendo que as restantes são denominadas de nurse cells. Nesta fase, os centrossomas das nurse cells agrupam-se e migram para o oócito, formando um grande COMT que se desintegra ao longo da oogénese, e que portanto, não participa na formação do fuso meiótico. No referido estudo observou-se que durante a oogénese a cinase Polo (Polo like kinase em humanos) é deslocalizada do centrosoma. Sendo a Polo responsável pelo recrutamento do material pericentriolar, também este é perdido durante o processo. Consistentemente, a remoção da Polo dos centríolos do oócito, leva à perda prematura de centrossomas durante a oogénese, ao passo que a expressão ectópica desta proteína com a sua localização forçada nos centríolos do oócito, leva à retenção de centrossomas até à fase de divisão meiótica, com acumulação de proteínas do material perientriolar. Esta retenção anormal de centrossomas nos óocitos levou à falha do desenvolvimento embrionário após a fertilização. Os resultados obtidos neste estudo e reproduzidos com sucesso em células de Drosophila, sugerem que as proteínas que formam o material pericentriolar, auxiliadas pela Polo, funcionam como um escudo protetor à volta dos centríolos impedindo a sua destabilização, o que pressupõe a existência de um mecanismo de manutenção da estabilidade dos centríolos. Em situações em que os centrossomas são eliminados, como nos oócitos, este mecanismo de estabilização é desativado: a Polo e as proteínas do material pericentriolar deixam de ser acumuladas no centrossoma, levando à sua destabilização e consequente eliminação. De forma semelhante ao que acontece na oogénese em Drosophila, em células diferenciadas - como o músculo esquelético, neurónios ou células epiteliais - a inativação dos centrossomas também parece ser realizada através da remoção das proteínas do material percientriolar, sugerindo que o mecanismo de estabilidade de centrossomas não é exclusivo para a oogénese, mas sim universal. Paralelamente, o mecanismo que permite a estabilização dos centrossomas mediado pelas proteínas do material pericentriolar e pela Polo permanece pouco claro. As proteínas do material pericentriolar poderão funcionar como um escudo que impede: (1) o acesso de proteínas que possam destabilizar os centríolos; ou (2) a saída de proteínas que contribuem para a estabilidade dos centríolos. De forma a identificar proteínas envolvidas no mecanismo de estabilização dos centríolos foi realizado um rastreio (screen) por RNA de interferência (RNAi) em células de Drosophila melanogaster bloqueadas na fase S durante oito dias. O bloqueio nas células em fase S impede o funcionamento do ciclo de duplicação de centríolos permitindo desacoplar estabilidade e biogénese centrossomal. Desta forma, o numero de centríolos é mantido constante, o que permite tirar vantagem para analisar o efeito (d)estabilizador das diferentes proteínas testadas. As células foram transfectadas com RNAi’s específicos para diferentes proteínas (proteínas candidatas) que foram descritas como fazendo parte da estrutura do centrossoma. Foram depletadas proteínas do material pericentriolar, proteínas centriolares como as da cartwheel, da parede centriolar e da zona distal do centríolo (cap) e ainda a Polo like kinase 4 (Plk4), a principal reguladora da biogénese dos centrossomas. O efeito que a remoção destas proteínas provocou na estabilidade dos centrossomas foi analisado através do número de centríolos por célula utilizando ensaios de imunofluorescência, no qual os centrossomas foram detetados utilizando anticorpos específicos para diferentes proteínas de diferentes partes/módulos do centrossoma. Os resultados obtidos foram comparados com um controlo (mCherry RNAi) e sempre que o número de centríolos era reduzido comparativamente ao controlo foi considerado que a proteína era importante para a estabilização do centrossoma. Os nossos estudos sugerem que os módulos que contribuem significativamente para a estabilidade dos centrosomas incluem proteínas do material pericentriolar, da parede centriolar e da cartwheel. Por outro lado, as proteínas da cap e Plk4 não parecem apresentar um papel relevante na estabilidade do centrossoma. De todas as proteínas candidatas testadas, a proteína da parede centriolar Ana1 revelou um dos fenótipos de perda de centríolos mais forte. Assim, prosseguimos com o estudo desta proteína in vivo. Simultaneamente, expressámos ectopicamente a Polo e depletámos a Ana1 nos centrossomas de óocitos de Drosophila. Observámos uma redução na manutenção dos centríolos em estádios avançados da oogénese sugerindo que a Ana1 apresenta um papel extremamente importante na estabilidade dos mesmos. Em conjunto, este estudo demonstra a importância das proteínas do material pericentriolar, da cartwheel e da parede centriolar para a manutenção e estabilização do centrossoma. Foi ainda possível identificar uma proteína que poderá ter um papel preponderante no mecanismo de estabilização dos centríolos. Contudo, é necessário investigar qual o papel dos diferentes módulos do centrossoma (o material pericentriolar, a cartwheel e a parede centriolar) na sua estabilização e compreender se estes têm funções específicas ou redundantes. É igualmente importante perceber qual o papel da Ana1 no mecanismo de estabilização dos centríolos, assim como a sua relação com a Polo e com as proteínas do material pericentriolar. Apenas o conhecimento detalhado do mecanismo que confere estabilidade aos centrossomas nos permitirá atuar sobre este mecanismo quando desregulado em doenças como o cancro.
Organelle inheritance and its persistence is essential not only upon cell division, but also differentiation, fertilization and disease. Amongst those, a structure that always raised much interest is the centrosome. The centrosome is the primary microtubule-organizing centre (MTOC) in animal cells, regulating cell shape and polarity in interphase, and spindle pole organization during mitosis. The centrosome is formed by two orthogonally arranged centrioles that are surrounded by a matrix of proteins called the pericentriolar material (PCM), which is essential for microtubule (MT) nucleation. Control of centriole number and function is very important, and dysfunction of these organelles is associated with a variety of human diseases. Despite being resistant to MT depolymerization and instability, centrosomes are eliminated from the oocytes from most metazoan species and can be inactivated in differentiated cells, suggesting that centrosomes are not intrinsically stable. It is not completely understood how centrosomes are eliminated or inactivated. However, a recent study in Drosophila melanogaster proved the existence of a centriole maintenance program. This program ensures centriole stability through PCM maintenance, which protects the centrosome, and is mediated by Polo kinase. To allow centriole elimination in the oocyte, this program is “shut down”. Perturbing this program prevents centriole loss and leads to female sterility. In order to identify new players involved in the centriole maintenance program, we performed a RNAi screen in Drosophila cultured cells. We chose candidate proteins that were described as components of the different modules of the centrosome and depleted them in S-phase arrested cells. We showed that while removal of some of the modules of the centrosome strongly destabilize the centrosome, others do not have a major effect in centrosome destabilization. Out of all the candidate proteins tested, the centriolar wall protein Ana1 showed the strongest effect on centrosome destabilization. We show that depletion of Ana1 in Drosophila oogenesis impairs PCM accumulation mediated by Polo, suggesting that this protein has a key role in the centriole maintenance program. Together, these results allowed us to identify the principal structural features that contribute to centrosome stability and also brought us new insights into the centriole maintenance program. However, further studies are needed to understand how this program is regulated which is important not only for successful sexual reproduction, but also for centriole life span and its impact on different tissues in homeostasis and disease, shaping the cytoskeleton.
Description: Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017
URI: http://hdl.handle.net/10451/31663
Designation: Mestrado em Bioquímica
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