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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/3547

Title: The role of hes genes in the controlled production of neurons
Authors: Fior, Rita, 1977-
Advisor: Henrique, Domingos, 1960-
Keywords: Comunicação celular
Sinalização Notch
Neurónios
Teses de doutoramento - 2007
Issue Date: 2007
Abstract: Cell–cell signalling mediated by the Notch pathway is essential for the spatial and temporal coordination of cellular behaviour in a variety of processes, from embryonic development and stem cell biology to disease. At the core of the Notch signalling pathway are the transmembrane Notch receptors and their ligands from the DSL ( D e lta– S e rrate– L a g-2) family. Upon ligand–receptor interaction, two proteolytic cleavages occur, releasing the N o tch i n tra- c e llular d o main (NICD). The NICD contains nuclear localization signals that render it to the nucleus where it associates with the DNA–binding protein CSL (mamalian C B F-1, Drosophila S u pressor of Hairless, C. elegans L a g-1) to activate expression of its target genes (Kopan, 2002). Notch signalling regulates neurogenesis in animals as different as flies and mammals. Notch signalling acts through a process known as Lateral Inhibition to balance the antagonistic activities of two different sets of bHLH proteins: the proneural proteins that play a positive role, promoting the commitment to a neural fate, and HES proteins that repress this cell fate decision. Cells that express Delta can activate the Notch receptor in neighbouring cells and this leads to transcriptional up–regulation of genes encoding HES proteins, which suppress the activity of the proneural genes and, thereby, keep these cells undifferentiated. In this way, the cell that expresses the ligand Delta realizes its neural potential, becoming a neuron, but simultaneously ensures that the neighboring cells are prevented from doing so. By restraining differentiation, Notch signalling not only ensures the maintenance of a progenitor population but enables cells to be exposed to the various environmental cues that are continuously changing over time, thus, allowing the production of the different types of neurons during the whole embryonic development. The aim of this work is to understand the molecular events downstream of Notch signalling used to control the production of neurons during vertebrate embryonic development. I have concentrated on the hes genes, which are the best characterized Notch targets and effectors. However, many questions remain regarding their general regulation and function. In this work, I describe four novel chick hes genes that are expressed in the developing nervous system: three hes5-like genes (hes5-1, hes5-2 and hes5-3) and one hes6-like (hes6-2). All four genes are expressed in the ventricular zone of the embryonic neuroepithelium, where neural progenitors are located and where the Notch1 receptor is expressed. I show that Notch signalling positively regulates the hes5 genes but reduces expression of hes6-2. Overexpression of HES5 proteins, like the constitutive activation of Notch signalling, leads to inhibition of neurogenesis, implying that hes5 genes are bonafide Notch effectors. Furthermore, this work unravelled a novel circuitry of auto- and cross- regulation between hes genes: each hes5 gene is able to repress hes6-2, and all three hes5 genes seem to be repressed by hes6-2. Moreover, hes5-1 and hes5-2 genes are subjected to negatively auto–regulation. This work proposes that the function of the HES5/HES6 circuitry is a conserved feature of the Notch pathway, modulating the response of neuroepithelial cells to Notch signals at different phases of their development. Neuronal progenitors seem to go through successive Notch activation events until they finally differentiate. In this work, I propose a model in which the HES5/HES6 circuitry of negative auto- and cross-regulation contributes to shut down the pathway after each event of Notch activation. This would enable the progenitors to go back to a “neither–ON–nor–OFF” steady state where they are ready to interact again through lateral inhibition or, in the absence of a Delta inhibitory signal, enter the neuronal differentiation program. In order to test this model and determine if these pulses of Notch activity indeed occur, I developed a real–time imaging system to monitor Notch activity in vivo. A reporter construct composed of the hes5-1 promoter, fused to a destabilized VENUS protein was generated. This reporter recapitulates the endogenous pattern of hes5-1 and responds to Notch signalling, providing a valuable tool to monitor Notch activity in real time. Analysis of time-lapse imaging of neuroepithelial cells containing this reporter revealed a dynamic gene expression pattern suggestive of pulses of Notch activity. The possible functional relevance of these oscillations to control the neurogenesis process is discussed in detail in the general discussion of this work.
O desenvolvimento de um organismo multicelular depende da capacidade de formar padrões biológicos organizados e reprodutíveis – e isto apenas é possivel se as células ‘falarem’ umas com as outras e influenciarem reciprocamente o seu comportamento e destino celular. Nestes processos de comunicação celular, uma das vias mais importantes é a via de sinalização Notch. A comunicação célula–célula mediada pela via de sinalização Notch é essencial para a coordenação espacial e temporal de uma variedade de processos celulares durante o desenvolvimento embrionário, na regulação da população de células ‘estaminais’ assim como em situações patológicas (Lai et al., 2004). Perturbações na via de sinalização Notch podem resultar em várias patologias humanas, como o síndrome de Alagile e CADASIL (Arteriopatia Cerebral Autosomal Dominante com Infartes Subcorticais e Leucoencefalopatias), afectando inúmeros orgãos e sistemas (Gridley, 2003). Defeitos na via de sinalização Notch estão também implicados em vários cancros, como leucemias de células T e cancro da mama (Gridley, 2004; Mastronardi and Moscarello, 2005; Radke, 2006). No centro da via de sinalização Notch encontram–se as proteínas transmembranares Notch e os seus ligandos, pertencentes à família DSL ( D e lta– S e rrate– L a g-2). Quando os ligandos numa célula interagem com os receptores de outra célula desencadeiam uma série de clivagens proteolíticas que levam à libertação do domínio intracelular do receptor Notch (NICD). Este domínio é então capaz de se dirigir ao núcleo, onde se associa com o factor the transcrição CSL ( C B F-1 de mamíferos, S u pressor of Hairless de Drosophila, L a g-1 de C.elegans) e MAM ( M a s ter m i nd) para activar a expressão dos seus genes alvo (Kopan et al, 2001). A neurogénese é um dos muitos processos que é regulado pela via de sinalização Notch, em animais tão diferentes como moscas e mamíferos. Neste processo, a via Notch actua através do processo de Inibição Lateral, balanceando a actividade antagonística de dois tipos de factores de transcrição: as proteínas proneurais que promovem a diferenciação neural e as proteínas HES que reprimem este processo. As células que expressam o ligando Delta podem activar o receptor Notch nas células vizinhas, conduzindo à activação transcriptional dos genes que codificam as proteínas HES que, por sua vez, suprimem a actividade dos genes proneurais, mantendo assim estas células num estado não diferenciado. Desta forma, a célula que expressa o ligando Delta concretiza o seu potencial neural, diferenciando-se num neurónio, mas simultaneamente assegura que as células vizinhas não fazem o mesmo, ou seja, não se diferenciem em neurónios. Esta diferenciação contida e controlada assegura a manutenção de uma população de células progenitoras durante todo o desenvolvimento. Este processo prolongado no tempo permite que as células progenitoras vão sendo expostas aos vários sinais exteriores que se encontram em contínua mudança, assegurando assim a produção dos diferentes tipos de neurónios durante todo o desenvolvimento embrionário. O objectivo do presente trabalho foi compreender melhor os eventos moleculares que ocorrem por consequência da activação da via de sinalização Notch, utilizados para controlar a produção de neurónios durante o desenvolvimento embrionário de animais vertebrados. O meu trabalho incidiu no estudo dos genes hes, sobre os quais, apesar de serem os alvos e efectores melhor caracterizados da via de sinalização Notch, muitas interrogações ainda permanecem a respeito da sua função e regulação. No murganho existem quatro genes hes que são expressos no tubo neural (hes1, hes3, hes5 e hes6), no entanto só um – o gene hes5, parece ser um verdadeiro alvo da via Notch in vivo (de la Pompa et al., 1997; Lutolf et al., 2002). No entanto, a delecção do gene hes5 não tem o mesmo fenótipo que a mutação no gene Notch1 durante a neurogénese, sendo necessária a inactivação simultânea do gene hes5 e de outros dois genes hes – hes3 and hes1, para se verificar o fenótipo esperado para a perda total da via Notch (Lewis, 1998) – a completa eliminação da população de progenitores neurais (Hatayama, 2004). Estes resultados sugerem que outros genes hes poderão participar na via Notch durante a neurogénese e que a sua regulação pela via Notch poderá ter sido mascarada por possiveis regulações inter–génicas. De acordo com esta hipótese, foi mostrado que o gene hes6 regula negativamente o gene hes1 (Bae et al., 2000; Koyano–Nakagawa et al., 2000; Gratton et al., 2003). No entanto, se o gene hes6 interage com outros genes hes é ainda uma questão em aberto. Mais, no contexto da segmentação foi demonstrado que os genes hes têm a capacidade de regularem a sua própria expressão (Hirata et al., 2002; Bessho et al., 2003). Este mecanismo de feedback negativo gera oscilações na expressão génica destes genes, com o mesmo periodo que a formação dos sómitos. Estas oscilações génicas parecem estar na base do relógio biológico que controla o processo da segmentação (revisto por Dubrulle and Pourquie, 2004). No entanto, durante a neurogénese, desconhece–se totalmente se estes genes hes têm um comportamento oscilatório ou sequer esta capacidade auto–regulatória . Assim, de modo a responder a estas questões e entender melhor a lógica inerente à produção controlada dos neurónios, eu comecei por caracterizar os genes hes de galinha, que até à data do inicio desta tese ainda não tinham sido estudados. Na presente dissertação são descritos quatro genes hes de galinha que são expressos no sistema nervoso: três genes hes5 (hes5-1, hes5-2 e hes5-3) e um hes6 (hes6-2). Os quatro genes são expressos na zona ventricular do neuroepitélio embrionário, onde se encontram os progenitores neurais e onde o receptor Notch1 é expresso. Neste trabalho é demonstrado que a via de sinalização Notch regula positivamente os genes hes5 mas reduz a expressão do gene hes6-2: quando a via Notch é activada os três genes hes5 são activados e o gene hes6-2 é reprimido. Pelo contrário, quando a via Notch é inibida, os genes hes5 são reprimidos e o gene hes6-2 é activado. A expressão ectópica das proteínas HES5 no neuroepitélio do embrião de galinha conduz a um fenótipo semelhante ao que ocorre quando se induz a activação constitutiva da via Notch: a neurogénese é inibida, indicando que os genes hes5 são verdadeiros efectores da via de sinalização Notch. Por outro lado, o gene hes6-2 inibe os efectores da via Notch, cooperando assim com os genes proneurais na progressão da via de diferenciação neural. Mais: este trabalho revela ainda a existência de um novo circuito de inter- e auto- regulação transcricional entre estes genes. Os quatro genes hes de galinha regulam-se uns aos outros: as proteínas HES5 têm capacidade de reprimir a expressão do gene hes6-2 e, por outro lado, os genes hes5 são reprimidos pela actividade de HES6-2. As proteínas HES5-1 e HES5-2 têm também a capacidade de regular negativamente a expressão dos seus respectivos genes. Este trabalho propõe que a função do circuito HES5/HES6 seja uma característica conservada da via de sinalização Notch, modulando a resposta das células neuroepiteliais a esta via de sinalização, em diferentes fases do desenvolvimento embrionário. Os progenitores neuronais deverão atravessar eventos sucessivos de activação da via Notch até que se diferenciem totalmente. Neste trabalho sugere-se um modelo em que o circuito HES5/HES6 de inter- e auto- regulação transcricional negativa contribui para terminar a actividade da via Notch após cada evento de activação. Isto permitirá aos progenitores voltarem para um estado “neither-ON-nor OFF ", onde estarão prontos para interagir outra vez através da Inibição Lateral ou, por outro lado, na ausência de um sinal inibitório Delta, entrarem no programa de diferenciação neural. Este modelo, ao ter em conta a cinética da via de sinalização Notch, de uma forma dinâmica, sugere uma nova perspectiva para a lógica que controla a produção dos neurónios e ainda sugere um mecanismo para regular a duração da sinalização Notch – o circuito de auto- e inter-regulação HES5/HES6. De modo a testar este modelo e determinar se os referidos pulsos de actividade Notch realmente ocorrem, foi desenvolvido um sistema para monitorizar a actividade da via Notch em tempo real. Para tal, foi construído um plasmídeo repórter composto pela região promotora do gene hes5-1, ligado a uma proteína fluorescente instável–VENUS. Este repórter é expresso na região ventricular do neuroepitélio, recapitulando o padrão de expressão do gene endógeno hes5-1. Mais: este plasmídeo reporter é induzido pela via de sinalização Notch, constituindo assim, uma ferramenta eficaz para monitorizar a actividade da via Notch em tempo real. A análise da actividade do repórter a nível celular revelou um padrão dinâmico da expressão do gene hes5, sugerindo a existência de pulsos de actividade da via Notch. A possível relevância funcional destas oscilações para controlar o processo do neurogénese é amplamente debatida na discussão geral da presente dissertação.
Description: Tese de doutoramento em Ciências Biomédicas (Ciências Morfológicas), apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Medicina, 2007
URI: http://hdl.handle.net/10451/3547
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