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Título: Efeito de flavonóides na captação de HOCI produzido por neutrófilos activados e modulação do factor de transcrição NF-kB em células THP -1: análise da relação estrutura - actividade
Autor: Garcia, Vanessa Sílvia Gomes
Orientador: Mira, Maria de Lurdes, 1949-
Palavras-chave: Inflamação
Flavonóides
HOCI
Neutrófilos
Células THP-1
Células NF-kB
Teses de mestrado - 2010
Issue Date: 2010
Resumo: Apesar das doenças inflamatórias estarem na base de diversas patologias, ainda não foiencontrada uma terapia adequada e universal para o tratamento das mesmas. As terapias anti-inflamatórias esteroides e não-esteróides tradicionais, ainda, não respondem eficazmente ou têm muitos efeitos colaterais associados. O ácido hipocloroso (HOCl) é um oxidante forte produzido por neutrófilos e monócitos activados e desde há muito tempo que lhe é reconhecido um papel fundamental no processo inflamatório. Embora a formação de HOCltenha como finalidade matar os microrganismos invasores dentro do fagossoma, pode serlibertado para fora da célula e levar à lesão dos tecidos contribuindo, deste modo, para apatogénese de doenças inflamatórias. Considerou-se, por isso, importante estudar aspropriedades anti-inflamatórias de alguns flavonóides, em relação à captação de HOCl gerado por neutrófilos activados ex vivo, bem como os seus efeitos na activação do factor de transcrição NF-κB.Em relação à captação de HOCl, para cada flavonóide foram determinados valores de IC50,através de diferentes métodos de competição: cloração da taurina e oxidação da sonda 3-aminofenilfluoresceína (APF), que foi seguida por espectrofluorimetria e citometria de fluxo. A miricetina e a quercetina apresentaram uma elevada actividade antioxidante com valores de IC50 semelhantes, apresentando características estruturais semelhantes que lhe permite ter um efeito protector em relação às reacções mediadas pelo HOCl. Estudou-se, também, a capacidade dos flavonóides induzirem variações na activação do NF-κBem células monocíticas THP-1 activadas por LPS por duas técnicas. Na transfecção com um plasmideo, acoplado ao gene repórter-kB, com uma sequência com elevada afinidade para o NF-kB e estimulação com LPS, observou-se uma elevada activação do promotor do NF-kB. No entanto, a presença de flavonóides (miricetina, canferol e isorrametina) leva a uma dimimuição da activação do promotor. De acordo com estes resultados observou-se, através da análise por western blot, uma diminuição da migração nuclear do p65-NF-kB, na presença de quercetina e miricetina. Estes resultados sugerem que os flavonóides estudados podem exercer efeitos antiinflamatórios, através da captação de HOCl e da inibição da activação do NF-κB.
Although inflammation underlies a large number of different diseases, a universal anti-inflammatory curative therapy has not been achieved yet. Indeed, the traditional steroidal or non-steroidal anti-inflammatory therapies are either not enough or associated with too many side effects. Hypochlorous acid (HOCl) is a powerful oxidant produced by stimulated neutrophils and monocytes and has long been recognized to play an important role in the inflammatory process. Although this toxic specie is generated with the aim of killing the invading microorganisms, inside the phagosome, it can also be released to the outside of the cell, where it may damage normal tissue and thus contribute to the pathogenesis of inflammatory diseases. Therefore it was considered of interest to study anti-inflammatory properties of some flavonoids towards the scavenging of HOCl generated by ex vivo activated human neutrophils, as well as their effects on the activation of the transcription factor NF-κB. In the HOCl scavenging assays, for each flavonoid, different IC50 values were obtained, when assessed through different competition methods: taurine chlorination and oxidation of 3- aminophenilfluorescein (APF) probe, which was followed by spectrofluorimetry and flow cytometry. Myricetin and quercetin showed high antioxidant activity with similar IC50 values, since they are analogs and possess those structural features that are determinant on the protection against HOCl The ability of flavonoids to induce changes in the activation of NF-κB in THP-1 cells activated by LPS was also examined using two different approaches. When cells were transfected with a plasmid coupled to a luciferase reporter gene containing a kB sequence with high affinity for NF-kB and stimulated by LPS, high activation on NF-kB promoter was achieved. In the presence of some flavonoids (myricetin, kaempferol and ishoramnetin) a decrease on activation of NFkB promoter was observed. Accordingly, it was observed by western blot analysis, a decrease in p65-NF-kB nuclear migration in the presence of myricetin and quercetin. These results suggest that the studied flavonoids may exert anti-inflammatory effects through the scavenging of HOCl and some of them through the inhibition of NF-κB activation.
Descrição: Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010
URI: http://hdl.handle.net/10451/3625
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