Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/36372
Título: CRISPR-Cas9 mutagenesis of the zebrafish foxm1
Autor: Carvalho, Ana Leonor Azevedo dos Santos
Orientador: Bessa, José
Rodrigues, Maria Gabriela,1965-
Palavras-chave: foxm1
Peixe-zebra
Senescência
Músculo
Teses de mestrado - 2018
Data de Defesa: 2018
Resumo: O ciclo celular é um processo vital aos eucariotas e o seu controlo é essencial para manutenção da homeostase dos organismos. Vários genes têm sido descritos como reguladores das diferentes fases deste processo, contribuindo para o desenvolvimento dos indivíduos. O FoxM1 é considerado o principal regulador deste ciclo em mamíferos. Este gene codifica um fator de transcrição que regula outros genes com papel relevante nas diferentes fases do ciclo celular, na regulação do metabolismo celular, na remodelação da matriz extracelular sinalização celular e na regulação transcricional. De acordo com as suas funções reguladoras, este gene está associado a proliferação celular. Esta associação atua ao nível de desenvolvimento embrionário, regeneração e reparação de tecidos, progressão e iniciação de processos tumorais e senescência celular. Em murganho, a perda deste gene é letal dando origem a alterações severas em órgãos vitais como coração, fígado e pulmões. Em linhas celulares a perda de FoxM1 resulta em fenótipos mitóticos associados ao envelhecimento e poliploidia. Recentemente, foi demonstrado que a expressão de FoxM1 em células senescentes é reduzida e, recuperando a expressão deste gene em fibroblastos humanos de dadores idosos o fenótipo é recuperado, assemelhando-se a amostras de fibroblastos jovens. Também genes-alvo de FoxM1 revelaram ter um papel importante no processo de envelhecimento sugerindo um envolvimento de FoxM1 no mesmo. O envelhecimento é um processo multifatorial complexo caracterizado pela perda gradual de integridade e funcionalidades dos tecidos e células. Este processo está associado a muitos fenótipos biológicos envolvidos em doenças crónicas. Entre estes fenótipos encontram-se descritos o decaimento da renovação celular, acumulação de células senescentes e disfunção mitótica do ciclo celular. A senescência celular consiste numa interrupção do ciclo celular com características fenotípicas e fisiológicas particulares incluindo a existência de um secretoma pro-inflamatório (SASP). Desta forma, as células senescentes podem influenciar as células adjacentes ao induzirem um efeito parácrino. Contudo, a avaliação in vivo do papel de FoxM1 no envelhecimento, usando animais modelo vertebrados, não foi ainda devidamente explorada. Neste projeto aplicou-se o sistema CRISPR-Cas9 para criar mutações no gene foxm1 do peixe-zebra (Danio rerio). Este modelo animal apresenta um padrão de envelhecimento gradual, semelhante ao que acontece em humanos. O peixe-zebra tem também o seu genoma totalmente sequenciado e possui pelo menos um ortólogo para a grande maioria de genes codificantes humanos. Também o seu desenvolvimento externo, transparência embrionária, custo, facilidade de manipulação e apresentação dos marcadores e fenótipos de senescência humanos tornam este modelo relevante no estudo de envelhecimento. Este vertebrado é facilmente manipulado geneticamente, permitindo a geração de diferentes mutantes através de técnicas de biologia molecular. O sistema CRISPR-Cas9 permite uma manipulação genética especifica através da criação de um complexo Cas9-sgRNA que se une a uma sequência especifica de interesse do DNA genómico e induz um corte da dupla cadeia de DNA. Os mecanismos celulares de reparação genómica são iniciados através da junção de extremidades não homólogas (NHEJ). Este processo é propenso a erros com inserção ou remoção de nucleotídeos resultando em mutações passíveis da inativação da proteína e silenciamento do gene. Neste projeto, as regiões-alvo de CRISPR-Cas9 correspondem ao segundo e oitavo exões do foxm1, sendo que apenas para o último foi possível obter mutações. O oitavo exão do foxm1 do peixe-zebra, corresponde à região inicial do domínio funcional da proteína. Na região equivalente do gene ortólogo em células humanas, foi demonstrado anteriormente que mutações neste local origina uma proteína com uma função dominante negativa. Inicialmente testou-se a funcionalidade do sistema CRISPR-Cas9 através de um sgRNA tendo como alvo E-GFP de uma linha estável com fluorescência no sistema nervoso central. Após verificação da operacionalidade da tecnologia testaram-se nove sgRNAs, seis para o segundo e três para o oitavo exão do foxm1. Para tal, extraiu-se DNA de embriões co-injetados com sgRNA e Cas9, amplificando-se o locus alvo por reação em cadeia da polimerase (PCR), correndo o produto amplificado num gel de policrilamida, tendo-se verificado a presença de homo e heteroduplexes. Heteroduplexes correspondem a cadeias que são apenas parcialmente complementares pela existência de mutações. Para o oitavo exão encontrou-se um sgRNA capaz de provocar mutações através de CRISPR-Cas9. Cresceram-se animais co-injetados com este sgRNA (sgRNA 8.3). No entanto, todas as mutações obtidas na progenia correspondem a pequenas deleções in-frame, sugerindo que a perda de foxm1 pode ser letal. Apesar disso, verificou-se a presença de uma mutação na lisina K315 em dois dos peixes injetados cuja descendência foi genotipada. Esta lisina é homologa à lisina K368 humana, a qual foi previamente identificada como um local de sumolação com impacto na atividade transcricional de FoxM1. Durante o envelhecimento ocorrem mecanismos celulares no músculo que opõe os processos de regeneração e reparação, verificando-se uma perda de massa muscular. Em mamíferos a miogénese está dependente de percursores musculares com expressão de Pax3 e Pax7. Em peixe-zebra pax7a contribui para o crescimento muscular ao longo da vida. Vários autores demonstraram o papel de Pax7 em reparação e regeneração muscular. Outros revelaram ainda a existência de uma de-diferenciação de células maturas sem recrutamento de progenitores em musculo de peixe-zebra. Assim, e numa abordagem complementar verificou-se a presença de expressão de foxm1 em células musculares diferenciadas de peixe-zebra. Para esta abordagem recorreu-se à criação de vetores específicos com o sistema CRISPR-Cas9 inativo (ausência de sgRNA) de modo a marcar as células do musculares com fluorescência (E-GFP), procedendo-se depois ao seu isolamento. Posteriormente, criou-se um vetor CRISPR-Cas9 ativo (com sgRNA) em células musculares diferenciadas marcadas por fluorescência (E-GFP) e, um vetor com fluorescência (mCherry) para marcação do mesmo tipo de células inalteradas (wild type). Ao inibir-se foxm1 em células musculares diferenciadas, observou-se que o seu número tende a diminuir lentamente ao longo do tempo. Adicionalmente, em embriões mosaicos com células mutadas, o número de células musculares inalteradas (wild type) tende a aumentar comparativamente com o controlo. Em defeitos musculares derivados do envelhecimento, a resposta regenerativa pode estar alterada devido a inflamação crónica, pois as células senescentes secretam moléculas, como interleucinas, que alteram o microambiente. A via de sinalização JAK-STAT tem um papel essencial na regeneração muscular, respondendo a IL-6 extracelular, proveniente de SASP e/ou processos inflamatórios, de reparação e regeneração. Neste contexto, embora as diferenças não sejam estatisticamente significativas, genes envolvidos em reparação e regeneração muscular tendem para o aumento em resposta a mutação de foxm1. Estes resultados sugerem que as células mutantes para foxm1 têm um papel não autónomo na homeostase do tecido muscular, compatível com a identidade das células senescentes. Por último, ao longo das experiências, descobriu-se que a expressão contínua de Cas9 em células transgénicas induz toxicidade. Este resultado mostra que as técnicas atuais de perda de função baseadas em vetores de expressão CRISPR-Cas9 devem ser melhoradas no futuro.
Aging is a complex process that has been associated with multiple biological phenotypes linked to chronic diseases, such as decay of cell renewal and accumulation of senescent cells. FoxM1, the transcription factor that primarily drives late cell cycle gene expression, has been recently assigned as a major regulator of cellular aging. To study the role of FoxM1 in organismal aging, we used the zebrafish model and the CRISPR/Cas9 gene editing system to generate loss-of-function foxm1 mutations. Strikingly, all the different isolated mutations corresponded to small in-frame deletions, suggesting that foxm1 loss-of-function is deleterious. In a complementary approach, we applied the same molecular tools to generate mosaics of differentiated muscle cells mutated for foxm1. We observed that the number of putative mutant cells tend to slowly decrease throughout time, whereas the number of labelled surrounding wild type cells tend to increase, when comparing with a control. In this context, preliminary results showed that the expression of genes involved in muscle regeneration and repair, as well as in senescence phenotype, reflected a tendency to increase. These results suggest that foxm1 expression potentially acts non-autonomously in muscle tissue homeostasis, which could be compatible with a senescent cell identity. Finally, during the course of our experiments, we also found that the continuous expression of Cas9 in transgenic cells induces toxicity. This result shows that the current techniques used for loss-of-function based CRISPR-Cas9 expression vectors must be improved.
Descrição: Tese de mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018
URI: http://hdl.handle.net/10451/36372
Designação: Mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento
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