Resposta humoral na infecção por VIH-2 : impacto no diagnóstico, prevenção e evolução viral

Abstract

Os indivíduos infectados pelo VIH-2 progridem mais lentamente do que os infectados pelo VIH-1, e estima-se que mais de 95% dos indivíduos infectados por VIH-2 estejam incluídos na definição clínica de long-term nonprogressors. Esta diferença faz do VIH-2 um potencial modelo de estudo de uma infecção VIH atenuada que pode fornecer uma visão única da patogénese da infecção VIH-1. Até ao momento, os mecanismos responsáveis pelo fenótipo atenuado do VIH-2 não são bem conhecidos. A carga viral plasmática é inferior nos indivíduos infectados pelo VIH-2 do que pelo VIH-1. Isto sugere que a principal diferença entre os dois tipos de VIH pode estar no grau de replicação viral, e presume que a resposta imunológica do hospedeiro contribui directamente para um controlo mais eficiente da replicação do VIH-2. Actualmente não existem dúvidas de que a maioria dos indivíduos infectados pelo VIH-1 ou VIH-2 produzem anticorpos neutralizantes (AcNT) autólogos e heterólogos. Contudo, existe alguma controvérsia sobre se os AcNT controlam de facto a replicação viral, uma vez que na maioria dos casos não se observa correlação inversa entre o título de AcNT e a carga viral plasmática. Na realidade, tanto no VIH-1 como no VIH-2, parece haver uma correlação directa entre o título de AcNT e a replicação viral o que sugere que a replicação viral é essencial para a produção de AcNT. Neste contexto, uma questão importante é saber como e quando serão induzidos os AcNT nos indivíduos infectados por VIH-1 e VIH-2 sem carga viral detectável. Em contraste com o VIH-1, não existem estudos que caracterizem de forma qualitativa e quantitativa a cinética da resposta humoral anti- VIH-2 nos primeiros dias da infecção uma vez que a infecção por este vírus é quase sempre detectada na fase crónica. Obter informação detalhada sobre os vírus que estabelecem as infecções por VIH-2 e sobre a natureza da resposta imunológica durante a fase aguda da infecção por VIH-2 é vital para a produção de uma vacina. Neste contexto, o principal objectivo desta tese foi caracterizar no decurso da infecção VIH-2 aguda e crónica, de forma qualitativa e quantitativa, a natureza e dinâmica da resposta humoral neutralizante e não neutralizante e caracterizar o impacto destes anticorpos na evolução molecular e fenotípica do vírus. Também foram analisados os alvos da resposta neutralizante anti-VIH-2 e o potencial de dois novos imunogénios VIH-2 para uma vacina. O primeiro estudo (Capítulo III) teve como objectivo caracterizar em detalhe a antigenicidade de dois polipéptidos recombinantes derivados das glicoproteínas de superfície (rpC2-C3) e transmembranar (rgp36) do VIH-2ALI, o isolado primário de referência do grupo A. Utilizando estes dois polipéptidos, produziu-se um novo teste imunoenzimático (ELISA-VIH2) que revelou ter a sensibilidade e especificidade necessárias para diagnosticar serologicamente a infecção por VIH-2. A reactividade dos plasmas VIH-2+ foi significativamente maior para o antigénio rgp36 do que para o rpC2-C3, sugerindo que o ectodomíno da rgp36 é a região antigénica imunodominante no invólucro do VIH-2. A resposta de anticorpos para o rpC2-C3 foi mais variável, permitindo agrupar os doentes conforme a produção de anticorpos seja baixa ou alta. O teste permitiu ainda confirmar a infecção VIH-2 em plasmas que apresentam dupla serologia por testes comerciais. Devido às características evidenciadas, o teste ELISA-VIH2 poderá ser uma excelente alternativa aos testes comerciais de diagnóstico serológicos e de confirmação da infecção por VIH-2. O formato de antigénio duplo apresentado no teste permite ainda caracterizar em termos quantitativos e qualitativos a evolução da produção de anticorpos para as glicoproteínas do invólucro do VIH-2 em doentes infectados. Os antigénios rpC2-C3 e rgp36 produzidos na primeira fase do trabalho foram reagentes essenciais para o segundo trabalho (Capítulo IV), em que a presença de anticorpos IgA e IgG inespecíficos e específicos para as proteínas do Env do VIH-2 foi analisada num grupo de doentes VIH-2 na fase aguda (crianças VIH- 2 positivas infectadas via perinatal) e crónica da infecção. Demonstrou-se que, tal como na infecção VIH-1, a activação inespecífica das células B também ocorre na infecção VIH-2 crónica mas só ao nível das células B secretoras de IgG, uma vez que a concentração total de IgA no plasma dos indivíduos positivos para o VIH-2 foi idêntica à dos indivíduos saudáveis não infectados por VIH (grupo controlo). Em relação à resposta humoral específica para as glicoproteínas do invólucro do VIH-2, observou-se uma associação inversa entre os anticorpos IgG anti-rpC2-C3 e o número de linfócitos T CD4+ o que sugere que estes anticorpos reflectem a progressão da infecção VIH-2. A maioria dos indivíduos também produziu anticorpos IgA para os dois polipéptidos, o que identifica pela primeira vez a região C2-C3 como um forte indutor de anticorpos IgA no soro e confirma a forte antigenicidade do ectodomíno da gp36. Apesar da amplitude da resposta IgA, não se observou nenhuma associação entre os anticorpos IgA anti-gp36 ou anti-gp125 e o estádio da doença como foi descrito para a infecção VIH-1. Em termos qualitativos (avidez) e quantitativos (titulo e concentração) a resposta IgG não neutralizante foi maioritariamente dirigida para a gp36. As subclasses de anticorpos IgG produzidas na fase crónica da infecção foram IgG1 (reactivos para ambos os polipéptidos) e IgG3 (reactivo para a gp36). Não se detectou nenhum efeito protector dos anticorpos IgG1 e IgG3 anti-gp36 na evolução clínica da SIDA, como foi sugerido para os anticorpos IgG2 anti-gp41 na infecção VIH-1. Contudo, numa análise longitudinal observou-se uma associação inversa significativa entre os anticorpos IgG anti-C2- C3 e o número de células T CD4+. Estes resultados são consistentes com a função imunoprotectora atribuída à região C2-C3 na infecção VIH-2. Uma vez que a resposta IgG anti-C2-C3 parece reflectir adequadamente o estado imunológico e a evolução clínica da infecção VIH-2, a concentração de anticorpos IgG anti-C2-C3 pode ser um marcador útil para monitorizar a progressão da doença na infecção VIH-2. O principal promotor da evolução molecular e fenotípica do VIH-1 é a pressão selectiva exercida inicialmente pela resposta celular citotóxica e depois pelos anticorpos neutralizantes. A informação sobre este assunto no VIH-2 é ainda muito limitada. No Capitulo V deste trabalho analisou-se longitudinalmente a evolução molecular das regiões C2, V3 e C3 do Env em 18 doentes VIH-2 recorrendo a métodos filogenéticos e moleculares e correlacionou-se esta evolução com a resposta humoral anti-Env. A média da diversidade nucleotídica intra-hospedeiro aumentou ao longo do curso da infecção na maioria dos pacientes. A diversidade ao nível dos aminoácidos foi significativamente mais baixa para a região V3 e mais elevada para a região C2. A taxa de evolução do VIH-2 na região que compreende os domínios C2, V3 e C3 região foi de 0,014 substituições/local/ano, que é semelhante à que tem sido referida para a infecção VIH-1 crónica. O número e posição dos locais seleccionados positivamente foi muito variável, excepto para os codões 267 e 270 na região C2 que estiveram sob uma pressão selectiva forte e persistente na maioria dos doentes. Os locais de glicosilação ligados á asparagina localizados na C2 e na V3 mantiveram-se conservados em todos os pacientes ao longo do curso da infecção. A variação intra-hospedeiro da resposta IgG específica para as regiões C2, V3 e C3, ao longo do tempo, estava inversamente associada à variação nos nucleótidos e diversidade dos aminoácidos na região C2-V3-C3. A variação da resposta IgA específica para a C2- V3-C3 estava inversamente associada à variação no número de locais N-glicosilação. Os resultados destes estudos demonstram que a dinâmica evolutiva do invólucro do VIH-2 durante infecções avirémicas crónicas é semelhante à do VIH-1, o que implica que o vírus deve estar em replicação activa nos compartimentos celulares. Contudo, a evolução convergente da N-glicosilação na C2 e V3 e a diversificação limitada da V3, indicam que existem factores funcionais importantes que constrangem a potencial diversidade do invólucro do VIH-2. Na globalidade, os resultados sugerem que: 1) os anticorpos IgG anti-C2V3C3 são potencialmente eficazes no controlo da população viral; 2) a região C3 é um alvo importante para os anticorpos IgA e a N-glicosilação desta região pode prevenir o reconhecimento de epitopos IgA. Actualmente, está provado que a maioria dos indivíduos infectados cronicamente por VIH-2 produz AcNT de largo espectro. No entanto, conhece-se muito pouco sobre a dinâmica evolutiva desta resposta neutralizante na infecção VIH-2 crónica e existe informação controversa sobre o papel dos AcNT no controlo da replicação viral. O objectivo do trabalho apresentado no Capitulo VI desta tese foi caracterizar a dinâmica evolutiva da resposta neutralizante na infecção VIH-2 crónica e a sua relação com a evolução molecular e fenotípica do VIH-2 e com a evolução da doença. Neste contexto, analisou-se longitudinalmente ao longo de 3-4 anos a resposta neutralizante dirigida contra isolados virais primários autólogos e heterólogos num grupo de doentes VIH-2. A maioria dos doentes (8/12) estava infectada com vírus que utilizavam o coreceptor CCR5 (R5) e apenas quatro doentes estavam infectados com vírus que utilizam o coreceptor CXCR4 (X4). Estes resultados confirmam que o CCR5 é o principal coreceptor utilizado pelo VIH-2 in vivo. A presença de anticorpos IgG neutralizantes contra isolados autólogos foi detectada apenas em doentes infectados com vírus R5. È de realçar que, os quatro doentes infectados com vírus X4 e dois com vírus R5, não produziram anticorpos capazes de neutralizar os vírus autólogos. Estes resultados demonstram pela primeira vez que o escape à neutralização é bastante frequente na infecção crónica por VIH-2 e que há uma forte relação entre tropismo e neutralização (R5> sensibilidade e X4> resistência, P <0.0001) do VIH-2. Com uma única excepção, todos os doentes testados desenvolveram AcNT contra isolados VIH-2 heterólogos de fenótipo R5. A amplitude desta resposta neutralizante heteróloga é superior à que se observa noutros estudos de neutralização em que foram utilizados pseudovírus e isolados primários de VIH-2. Contudo, tal como observado anteriormente, nenhum dos doentes produziu anticorpos neutralizantes contra isolados X4. A ausência de AcNT autólogos e heterólogos para os isolados X4 sugere fortemente que o escape do VIH-2 à neutralização in vivo está associado a alterações no tropismo celular (passagem de R5 para X4). Na infecção VIH-1, os estudos existentes sobre este assunto sugerem que não há uma relação entre a susceptibilidade dos vírus e o escape à neutralização e a utilização de coreceptores. Demonstrou-se pela primeira, que a potência dos AcNT está inversamente associada com os anticorpos de ligação para a rpC2-C3 (título e avidez) e não para a rgp36. Estes resultados sugerem fortemente que os AcNT anti-VIH-2 têm como principal alvo as regiões C2, V3 e C3 no Env e que a maturidade é um factor importante na sua actividade neutralizante. As diferenças mais significativas entre os vírus R5 sensíveis à neutralização e os vírus X4 resistentes à neutralização ocorreram na região V3. Os vírus resistentes aos AcNT tinham a região V3 mais longa e um número maior de aminoácidos carregados positivamente. Estes dados sugerem que a V3 é o principal alvo dos AcNT dentro do domínio C2- V3-C3. Tal como acontece com o VIH-1 são necessárias novas estratégias de prevenção da infecção VIH-2. O último objectivo desta tese (Capítulo VII) foi produzir novos imunogénios derivados do isolado de referência do grupo A, VIH-2ALI e avaliar o seu potencial neutralizante a nível pré-clínico em ratinhos. As proteínas nativas ou truncadas do invólucro do VIH-2ALI foram expressas em vírus da vacina e bactérias. A imunização de murganhos Balb\C com a gp125 truncada (gp125t) ou com o polipéptido rpC2-C3 só induziu uma resposta de anticorpos de ligação, semelhante à que o VIH-2 induz no homem, mas não induziu a produção de AcNTs. No entanto, a indução de AcNTs pelas mesmas proteínas monoméricas foi muito eficiente quando se imunizou previamente os animais com o vírus da vacina a expressar quantidades elevadas de gp125t. Os anticorpos desenvolvidos neutralizaram apenas vírus R5, que são, vírus com fenótipo igual ao do vírus que originou os imunogénios vacinais (VIH- 2ALI). Os vírus X4 resistentes à neutralização apresentavam alterações importantes na sequência e estrutura da região V3, que divergiam significativamente da sequência aminoacídica, da carga total, tamanho e conformação da região V3 do VIH-2ALI. Globalmente, os resultados destes estudos demonstraram, pela primeira vez, que AcNT amplamente reactivos contra o VIH-2 podem ser obtidos utilizando uma estratégia de imunização que consiste num priming com vírus da vacina recombinante a exprimir a glicoproteína monomérica gp125 seguida de reforços com o polipéptido rpC2-C3. Os resultados sugerem ainda que a região V3 é um domínio neutralizante de largo espectro no VIH-2 e confirmam a ligação existente entre o escape à neutralização e o tropismo X4 na infecção VIH-2 (Capítulo VI). Em conclusão, os resultados obtidos nesta tese permitem evidenciar o papel central que a região C2-V3-C3 do Env tem na infecção VIH-2 e o impacto que pode ter no diagnóstico, monitorização e prevenção da infecção por este vírus. Por um lado, esta região é altamente antigénica, o que se revelou útil no diagnóstico serológico da infecção. Por outro lado, a associação inversa entre a resposta humoral contra esta região e o número de linfócitos T CD4+ significa que o nível de anticorpos anti-C2V3C3 é útil para monitorizar o estado imunológico e a evolução clínica de indivíduos infectados por VIH-2. As regiões C2, V3 e C3 contêm os determinantes antigénicos responsáveis pela indução de AcNT de elevada potência e ampla reactividade que são comuns nos indivíduos infectados por VIH-2. Estes resultados, em associação com as experiências de imunização em ratinho, sugerem fortemente que uma vacina para o VIH-2 deve direccionar a resposta humoral contra a C2, V3 e C3 na gp125. Contudo, ao contrário do que se presumia até aqui, a emergência de vírus resistentes à neutralização é comum na infecção por VIH-2 e está principalmente associada à emergência de vírus com tropismo X4 e com maior patogenicidade. Isto deve ser tido em conta na concepção de uma vacina para o VIH-2. Estes resultados também são relevantes para a utilização de antagonistas do CCR5 em pacientes VIH-2.

Individuals infected with HIV-2 progress more slowly than those infected by HIV-1, and it is estimated that over 95% of individuals infected by HIV-2 are included in the clinical definition of long-term nonprogressors. This difference makes HIV-2 a potential model of an attenuated HIV infection that can provide a unique insight into the pathogenesis of HIV-1 infection. So far, the mechanisms responsible for the attenuated phenotype of HIV-2 are not well known. Plasma viral load is lower in individuals infected with HIV-2 comparing to those infected with HIV-1. This suggests that the main difference between the two types of HIV may be at the level of viral replication, and assumes that the host immune response contributes significantly to a more efficient replication control of HIV-2. Currently, there is no doubt that the majority of individuals infected with HIV-1 or HIV-2 produce autologous and heterologous neutralizing antibodies (NAb).However there is some controversy over whether the NAb effectively control viral replication, since most cases have not shown an inverse correlation between the titer of NAb and plasma viral load. In fact, both HIV-1 and HIV-2 seems to show a direct correlation between the titer of NAb and viral replication suggesting that viral replication is essential for the production of NAb. In this context, an important question is how and when the NAb are induced in individuals infected with HIV-1 and HIV-2 without detectable viral load. In contrast to HIV-1, there are no studies that characterize both qualitatively and quantitatively the kinetics of the anti-HIV-2 humoral response in the first days of infection since the infection by this virus is often detected in chronic phase. To get detailed information on viruses that establish HIV-2 infections and on the nature of the immune response during the acute phase of infection by HIV-2 is vital for the production of a vaccine. In this context, the main objective of this thesis was to characterize the course of acute and chronic HIV-2 infection, both qualitatively and quantitatively, the nature and dynamics of the neutralizing and non-neutralizing humoral antibody response and characterize the impact of these antibodies on the molecular and phenotypic evolution of the virus. We also analyzed the anti-HIV-2 neutralizing response targets and the potential of two HIV-2 new immunogens for a vaccine. The first study (Chapter III) aimed to characterize in detail the antigenicity of two recombinant polypeptides derived from the surface (rpC2-C3) and transmembrane glycoproteins (rgp36) of HIV 2ALI, the reference group A primary isolate. Using these two polypeptides, a new enzyme linked immunoassay (ELISA-HIV2) was established that had enough sensitivity and specificity to diagnose HIV-2 infection serologically. The reactivity of HIV-2+ plasma was significantly higher for antigen rgp36 than for rpC2-C3, suggesting that the ectodomain of rgp36 is the immunodominant antigenic region in the envelope of HIV-2. The antibody response to the rpC2- C3 was more variable, allowing grouping of patients according to low or high antibody production. The test also allowed us to confirm HIV- 2 in plasma samples that have dual serology result with commercial tests. Due to the observed characteristics, the ELISA-HIV2 may be a great alternative to commercial tests for serological diagnosis and for confirmation of infection by HIV-2. The format of double antigen presented in the test also allows for characterization, in a quantitative and qualitative manner, of the evolution of antibody production against the envelope glycoproteins of HIV-2 in infected patients. The rpC2-C3 and rgp36 antigens produced in the first phase of this study were essential reagents for the second work (Chapter IV) in which the presence of specific and nonspecific IgA and IgG antibodies against HIV-2 Env proteins were analyzed in a group of HIV-2 patients in the acute (HIV-2 positive children perinatally infected) and chronic phase of infection. It was shown that, as in HIV-1 infection, nonspecific activation of B cells also occurs in chronic HIV- 2 infection but only at the level of B cells secreting IgG, since the total concentration of IgA in the plasma of positive individuals for HIV-2 was identical to that of healthy individuals not infected with HIV (control group). Regarding the specific humoral response to the envelope glycoproteins of HIV-2, we observed an inverse association between anti rpC2-C3 IgG and the number of CD4+ T lymphocytes which suggests that these antibodies reflect the progression of HIV-2 infection. Most individuals also produced IgA antibodies against both polypeptides, which identifies for the first time C2-C3 region as a strong inducer of IgA antibodies in serum and confirms the strong antigenicity of the ectodomain of gp36. Despite the magnitude of IgA response, there was no association between IgA anti-gp36 or antigp125 and the stage of disease as described for the HIV-1 infection. In qualitative (avidity) and quantitative terms (titer and concentration) the non-neutralizing IgG response was mainly directed to the gp36. The subclasses of IgG antibodies produced in the chronic phase of infection were IgG1 (reactive to both polypeptides) and IgG3 (reactive to gp36). Any protective effect of anti-gp36 IgG1 and IgG3 on clinical AIDS was not detected, as has been suggested for the anti-gp41 IgG2 in HIV-1 infection. However, a longitudinal analysis revealed a significant inverse association between anti-C2-C3 IgG antibodies and the number of CD4+ T cells. These results are consistent with the immune protective role assigned to the C2-C3 region in HIV-2 infection. Since the anti-C2- C3 IgG response seems to adequately reflect the immunological status and clinical outcome of HIV-2 infection, the concentration of anti-C2-C3 IgG may be a useful marker for monitoring disease progression in HIV-2 infection. The main promoter of molecular and phenotypic evolution of HIV-1 is the selective pressure exerted initially by cytotoxic cellular response and thereafter by neutralizing antibodies. In HIV-2, the information on this subject is still very limited. In Chapter V of this study we analyzed the molecular evolution of C2, V3 and C3 Env regions longitudinally, in 18 HIV-2 patients using molecular and phylogenetic methods and we correlated these changes with anti-Env humoral response. The mean intra-host nucleotide diversity has increased over the course of infection in most patients. The diversity at amino acid level was significantly lower for V3 region and higher for C2 region. The rate of evolution of HIV-2 in the region comprising the C2, V3 and C3 domains was 0.014 substitutions/site/year, which is very similar to what has been referred to for chronic HIV-1 infection. The number and position of positively selected sites was highly variable, except for codons 267 and 270 in the C2 region that were under a strong and persistent selective pressure in most patients. The N-linked glycosylation sites located in C2 and V3 remained preserved in all patients throughout the course of infection. The intra-host specific IgG response for the regions C2, V3 and C3, over time, was inversely associated with variation in nucleotide and amino acid diversity in C2-V3-C3 region. The variation of specific IgA response to C2-V3-C3 was inversely associated with variation in the number of N-glycosylation sites. The results of these studies show that the evolutionary dynamics of HIV- 2 envelope during non viremic chronic infections is similar to HIV-1, which implies that the virus must be actively replicating in cellular compartments. However, the convergent evolution of N-glycosylation in C2 and V3 and the limited diversification of V3, indicates that there are important functional factors that constrain the potential diversity of HIV-2 envelope. Overall, the results suggest that: 1) anti C2V3C3 IgG antibodies are potentially effective in controlling viral population; 2) the C3 region is an important target for IgA antibodies and N-glycosylation of this region can prevent recognition of IgA epitopes. Currently, there is evidence that the majority of individuals chronically infected with HIV-2 produce a wide spectrum of NAb. However, very little is known about the evolutionary dynamics of neutralizing response in chronic HIV-2 infection and controversial information exists on the role of NAb in controlling viral replication. The aim of the work presented in Chapter VI of this thesis was to characterize the evolutionary dynamics of neutralizing response in chronic HIV-2 infection and its relationship with the molecular and phenotypic evolution of HIV-2 and with the evolution of the disease. In this context, we analyzed longitudinally over 3-4 years the neutralizing response directed against autologous and heterologous primary viral isolates in a group of HIV-2 patients. Most patients (8 out of 12) were infected with viruses that used the CCR5 coreceptor (R5) and only four patients were infected with viruses that used the CXCR4 coreceptor (X4). These results confirmed that CCR5 is the principal coreceptor used by HIV-2 in vivo. The presence of neutralizing IgG antibodies against autologous isolates was detected only in patients infected with R5 virus. Remarkably, four patients infected with X4 virus and two with R5 virus, failed to produce antibodies capable of neutralizing autologous viruses. These results show for the first time that neutralization escape is quite common in chronic infection by HIV-2 and there is a strong correlation between tropism and neutralization (R5> sensitive and X4> resistant, P>0.0001) of HIV-2. With only one exception, all patients tested developed NAb against heterologous HIV-2 isolates with R5 phenotype. The breadth of this heterologous neutralizing response is higher than that observed in other neutralization studies where pseudovirus and primary isolates of HIV-2 were used. However, as noted earlier, none of the patients produced neutralizing antibodies against X4 isolates. The absence of autologous and heterologous NAbs against the X4 isolates, strongly suggests that escape of HIV-2 from neutralization in vivo is associated with changes in cell tropism (transition from R5 to X4). In HIV-1 infection, the existing studies on this subject suggest that there is no relationship between virus susceptibility and escape from neutralization and coreceptor usage. We demonstrated for the first time that the potency of NAb response was inversely associated with binding antibodies to rpC2-C3 (titer and avidity) but not to rgp36. These results strongly suggest that the HIV-2 NAb mostly target the C2, V3 and C3 regions in Env and that maturity is an important factor in their neutralizing activity. The most significant differences between the R5 virus sensitive to neutralization and X4 viruses resistant to neutralization occurred in the V3 region. NAb-resistant viruses had the longest V3 region and a larger number of positively charged amino acids. These data suggest that V3 is the main NAb target within the C2-V3-C3 domain. As for HIV-1, new strategies for prevention of HIV-2 infection are required. The final objective of this thesis (Chapter VII) was to produce new Env immunogens derived from the reference isolate of group A, HIV-2ALI and evaluate their neutralizing potential at a preclinical level in the mice model. Native or truncated proteins of the HIV-2ALI envelope were expressed in vaccinia virus and bacteria. The immunization of Balb\C mice with the truncated gp125 (gp125t) or with the polypeptide rpC2-C3 induced a binding antibody response, similar to the one HIV-2 induces in man, but did not induce the production of NAb. However, the induction of NAb from the same monomer proteins was highly efficient when the animals were previously immunized with vaccinia virus expressing high amounts of gp125t.The antibodies developed neutralized only R5 virus, that is, virus with the same phenotype of the virus that originated the vaccine immunogens (HIV-2ALI). X4 viruses resistant to neutralization showed significant changes in the sequence and structure of the V3 region, which diverged significantly from the amino acid sequence, the total charge, size and conformation of the V3 region of HIV-2ALI. Overall, the results of these studies demonstrated, for the first time, that NAb broadly reactive against HIV-2 can be obtained using an immunization strategy consisting of priming with a recombinant vaccinia virus expressing the monomer glycoprotein gp125 followed by boosting immunizations with the polypeptide rpC2-C3. The results also suggest that the V3 region is a broad spectrum neutralizing domain in HIV-2 and confirm the link between neutralizing escape and X4 cell tropism in HIV-2 infection (Chapter VI). In conclusion, the results obtained in this thesis highlight the central role that the C2-V3-C3 Env region plays in HIV-2 infection and the impact that it may have on the diagnosis, monitoring and prevention of infection by this virus. On one hand, this region is highly antigenic, which has proved useful in serological diagnosis of infection. On the other hand, the inverse association between the humoral response against this region and the number of CD4+ T lymphocytes means that the level of anti-C2V3C3 antibodies is useful for monitoring the immune status and clinical outcome of infected individuals by HIV-2. The C2, V3 and C3 regions contain the antigenic determinants responsible for induction of potent and broadly reactive NAb which are common in individuals infected with HIV-2. These results, in combination with immunization experiments in mice strongly suggest that a vaccine against HIV-2 should drive the humoral response against C2, V3 and C3 in gp125. However, unlike what was assumed until now, the emergence of neutralization resistant virus is common in HIV-2 and, most importantly, is associated with the emergence of viruses with X4 tropism and higher pathogenicity. This has to be taken into account in the design of a vaccine against HIV-2. These results are also relevant for the use of CCR5 antagonists in HIV-2 patients.