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Title: Caracterização molecular de produtos de recombinação ilegítima envolvendo o agrupamento génico CYP21A1P-CYP21A2 em doentes com hiperplasia supra-renal congénita
Authors: Tarelho, Ana Rita Abrantes
Advisor: Gonçalves, João
Antunes, Maria Augusta da Gama, 1960-
Keywords: Biologia molecular
Hiperplasia supra-renal congénita
Teses de mestrado - 2011
Issue Date: 2011
Abstract: A hiperplasia supra-renal congénita devido à deficiência 21-hidroxilase é uma das doenças autossómicas recessivas mais comum no Homem. A 21-OHD compromete a biossíntese de cortisol, levando a um aumento dos androgénios supra-renais e consequente virilização dos genitais externos em fetos femininos. O gene codificante da 21-OH, CYP21A2, encontra-se, juntamente com o seu pseudogene (CYP21A1P), no agrupamento RCCX (6p21.3). A estrutura mais comum deste agrupamento compreende os seguintes genes: Telómero-5’-RP1-C4A-CYP21A1P-TNXA-RP2-C4B-CYP21A2-TNXB-3’-Centrómero. Uma caracterização molecular completa e segura de 21-CAH requer não só uma estratégia que permita a detecção de variações na sequência do gene CYP21A2 mas também metodologias que permitam a detecção de variações no número de cópias do gene, conversões e quimeras. Para a detecção destas alterações estruturais e numéricas envolvendo o gene CYP21A2 e o pseudogene CYP21A1P, o Shouthern-blotting foi a técnica mais utilizada até recentemente. Apesar desta metodologia permitir a detecção das referidas alterações no agrupamento RCCX é uma técnica trabalhosa e morosa que requer grandes quantidades de DNA e implica o uso de radioactividade. Para além disso esta não permite a caracterização da extensão de conversões ou quimeras. Este trabalho avalia o uso de MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification), uma técnica recente para avaliação do número de cópias de genes, no estudo de alelos recombinantes no agrupamento RCCX, em particular aqueles envolvendo o gene CYP21A2 e o pseudogene CYP21A1P, salientando as possibilidades e limitações desta técnica especialmente numa perspectiva de diagnóstico molecular da 21-CAH. Neste estudo foram caracterizados molecularmente, por recurso a MLPA e outras técnicas moleculares, um total de 200 alelos: 94 alelos com alterações estruturais e/ou numéricas envolvendo os gene CYP21A2 e/ou CYP21A1P (38 duplicações, 17 delecções, 20 macroconversões, 19 quimeras), 43 alelos bimodulares com mutações pontuais em CYP21A2 e 63 alelos normais. De entre os alelos estudados este trabalho reporta um indivíduo que apresenta características fenotípicas de 21-OHD, homozigótico para o alelo com duplicação de CYP21A2 com a cópia proximal ao centrómero mutada. Este caso poderá contribuir para o esclarecimento da presente controvérsia sobre a funcionalidade das cópias duplicadas de CYP21A2. Finalmente, é descrito um caso único de um alelo com uma delecção extensa desde o intrão 9 de CYP21A2 ao exão 33 de TNXB encontrado em 3 doentes não consanguíneos com 21-OHD mas com a mesma origem geográfica, Cabo Verde. Este é o primeiro alelo descrito cujo presumível evento que originou a delecção não envolve dois genes parálogos no agrupamento RCCX.
Congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency (21-OHD) is one the most common autosomal recessive disorders. 21-OHD impairs cortisol biosynthesis leading to increased adrenal androgens and external genitalia virilisation in female foetus. The 21-OH coding gene, CYP21A2, lies together with its pseudogene (CYP21A1P) in the RCCX cluster (6p21.3). The most common structure of this cluster comprises the following genes: Telomere-5’-RP1-C4A-CYP21A1P-TNXA-RP2-C4B-CYP21A2-TNXB-3’-Centromere. A complete and safe molecular characterization of the 21-OHD requires not only a strategy that enables the detection of sequence variations on the CYP21A2 gene but also methodologies that enable the detection of gene copy number variations and hybrid genes. For detection of these structural and numerical alterations involving the CYP21A2 gene and the CYP21A1P pseudogene, Southern-blotting was the most frequently used methodology in recent times. Although this methodology allows the detection of these alterations on RCCX cluster it is a laborious and time consuming technique which requires large amounts of DNA and implies the use of radioactivity. In addition this technique does not allow the characterization of the extension of conversions or chimeras. This work evaluates the use of MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification), a recent technique for gene copy number assessment, in the study of the RCCX cluster recombined alleles, particularly those involving the CYP21A2 gene and CYP21A1P pseudogene, highlighting the possibilities and limitations of this technique specially concerning the molecular diagnostic purpose. In this context it were molecular characterized, by MLPA and other molecular techniques, a total of 200 alleles: 94 alleles with structural and/or numerical alterations involving the CYP21A2 and/or CYP21A1P (38 duplications, 17 deletions, 20 macroconversions, 19 chimeras), 43 bimodular alleles with point mutations on CYP21A2 gene and 63 normal alleles. Furthermore, this work reports an individual presenting a phenotype characteristic of 21-OHD, homozygous for a duplicated CYP21A2 allele with the 3’-centromeric copy mutated which may highlight the ongoing controversy about the functionality of CYP21A2 duplicated copies. Finally, we report a unique allele with a deletion extending from intron 9 of CYP21A2 to exon 33 of TNXB found in 3 non consanguineous 21-OHD patients with the same geographical origin, Cape Verde. This allele is the first to be reported resulting from an event not involving two paralog genes in the RCCX cluster.
Description: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011
URI: http://hdl.handle.net/10451/3820
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