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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/3944

Title: Phosphorylation of CFTR and other membrane proteins: a role in biogenesis and traffic?
Authors: Romeiras, Francisco Maria de Sousa de Macedo Malta
Advisor: Farinha, Carlos Miguel Ribeiro da Silva, 1973-
Keywords: CFTR
Fibrose quística
Fosforilação
CK2
SYK
AMPK
Metformina
Teses de mestrado - 2009
Issue Date: 2009
Abstract: Cystic Fibrosis (CF), the most common lethal autosomal recessive disorder among Caucasians, is caused by mutations in the gene that encodes for the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR). With more than 1600 mutations reported, a single mutation– the deletion of phenylalanine residue at position 508 – accounts for more than 70% of chromosomes worldwide. The presence of this mutation causes CFTR retention at the endoplasmic reticulum (ER) and its early degradation at the proteasome. We have studied the effect of AMPK phosphorylation on a CFTR variant (S573C) found in non-CF patients with pancreatitis. This variant was found to be less functional than wt-CFTR and more sensitive to AMPK phosphorylation. Our results suggest that S573 plays an important role in channel gating. We have also studied the effect of CK2 phosphorylation upon CFTR function and found that TBB inhibits wt-CFTR currents without affecting F508del-CFTR. Further insight was achieved by mutating three putative CK2-phosphorylation sites. (S422, S511 and T1471). Mutating S511 (A or D) did not have any detectable effect upon wt-CFTR function, while mutating S422 (A or D) significantly, decreases or increases CFTR function, respectively. Both T1471A- and T1471D-CFTR are less functional than wt-CFTR, and significantly inhibitable by TBB, similarly to S422 mutants. These data suggest that CK2 may be a positive effector for CFTR biogenesis, trafficking or function. Mutating Y512, the SYK consensus phosphorylation site, into an A results in a significant increase in CFTR function in both wt- and F508del backgrounds. This mutation may cause a conformational change that favours channel gating. Altogether, these data provide novel insight into CFTR regulation by phosphorylation and thus to our understanding of the molecular mechanisms that govern its trafficking and/or function.
A fibrose quística é a doença autossómica recessiva mais comum na população caucasiana, com uma incidência de 1:2500. Esta doença monogénica letal é caracterizada pela produção de muco extremamente espesso pelas células epiteliais que revestem os pulmões, que leva consequentemente à obstrução das vias aéreas e ao aparecimento recorrente de infecções bacterianas. A perda de função pulmonar é responsável por 95% da mortalidade. Além disso, a fibrose quística é também caracterizada por insuficiência pancreática exócrina, infertilidade masculina e funcionamento incorrecto das glândulas sudoríparas - elevando a concentração de electrólitos no suor, observação que está na base do mais clássico método de diagnóstico da doença - o teste do súor. Tanto a esperança média de vida como a qualidade de vida dos doentes de fibrose quística têm vindo a aumentar nos últimos anos, sobretudo devido aos avanços no controlo dos sintomas desta doença, sobretudo, incluindo fisioterapia, administração de antibióticos e suplementos enzimáticos. A base molecular desta doença foi elucidada em 1989 com a clonagem do gene que codifica para a proteína CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). Esta proteína pertence à família dos transportadores ABC (ATP-binding cassette) e funciona como canal de cloreto activado por cAMP e PKA (Protein Kinase A), na membrana apical de células epiteliais. A ausência de secreção de cloreto pela proteína CFTR e a hiperabsorção de sódio através do canal epitelial de sódio (ENaC) levam a um aumento da absorção de água e consequente desidratação do muco que reveste as vias aéreas, aumentando a sua viscosidade e facilitando a colonização bacteriana. Desta forma, o organismo tende a desenvolver uma resposta inflamatória contínua, levando a uma perda progressiva da função pulmonar e, em última análise, à morte. Dados mais recentes indicam que a CFTR está também envolvida na secreção de bicarbonato pelas células do ducto pancreático, apesar do mecanismo exacto pelo qual actua não ser consensual. A secreção de bicarbonato pode ocorrer directamente através da CFTR ou através da troca com cloreto, que será continuamente secretado pela CFTR para o lúmen do ducto pancreático. A CFTR contém 1480 resíduos de aminoácidos e é constituída por 5 domínios: 2 domínios transmembranares (TMD) que formam o canal iónico, 2 domínios de ligação a nucleótidos (NBD), cada um com a capacidade de ligar uma molécula de ATP, essenciais para a abertura do canal, e um domínio de regulação (R), fosforilado por diversos cinases e principal responsável na regulação da função da CFTR- Apesar de existirem mais 1600 mutações descritas no gene CFTR, a mutação mais comum consiste na delecção de um resíduo de fenilalanina na posição 508 (F508del) da cadeia polipeptídica. Esta mutação, que está presente em 70% cerca dos cromossomas, causa a retenção da proteína CFTR no retículo endoplasmático e o seu rápido envio para degradação pela via da ubiquitina-proteassoma. Nos últimos anos, têm-se identificado proteínas que interagem com a CFTR e que regulam a sua biogénese, trafégo intracelular e função. Entre estes alguns cinases como AMPK (monophosphate stimulated kinase), CK2 (casein-kinase 2) e SYK (spleen tyrosine kinase) têm merecido interesse crescente. Nesta dissertação, pretende-se estudar o efeito da fosforilação por estes cinases na função da CFTR. O AMPK é um cinase ubíquo que fosforila resíduos de serina ou treonina. O AMPK é activado por uma diminuição dos níveis de ATP na célula, estimulando vias catabólicas que levam à produção de ATP e inibindo vias anabólicas que consomem ATP, quer através da fosforilação de enzimas metabólicos quer pela regulação da sua expressão génica. O AMPK liga-se ao terminal carboxilo da proteína CFTR, fosforilando-a e inbindo a sua função como canal de cloreto. Os principais agonistas do AMPK são a metformina e fenformina, responsáveis por uma diminuição da produção de ATP na célula, através da inibição do complexo I da cadeia respiratória. O CK2 é um cinase heterotetramérico, constituído por duas subunidades catalíticas α ou α’ e duas subunidades regulatórias β, que fosforila resíduos de serina e treonina com a sequência de consensus Ser/Thr – X – X – Glu/Asp. O CK2 fosforila proteínas envolvidas na síntese, folding e degradação proteica e é inibido especificamente pelo tetrabromobenzotriazolo (TBB). Por ser uma proteína antiapoptótica, é um alvo hipotético para a criação e actuação de novos fármacos anti-cancerígenos. O SYK pertence à subfamília SYK/ZAP70 dos cinases de tirosina e participa em diversos processos de sinalização molecular através de receptores de células do sistema imunitário. O SYK é constituído por dois domínios SH2 seguidos de um domínio catalítico e fosforila resíduos de tirosina com a seguinte sequência de consensus Tyr – Asp/Glu – Asp/Glu. Em primeiro lugar, estudou-se o efeito da fosforilação de uma variante da CFTR (S573C) pelo cinase ubíquo AMPK. Esta mutação tem uma incidência aumentada em pacientes de pancreatite que não tinham fibrose quística. Os nossos resultados mostram que a proteína mutante resultante (S573C-CFTR) é menos funcional do que a proteína nativa (wt-CFTR) e mais sensível à metformina, um agonista do cinase AMPK usado no tratamento da diabetes mellitus tipo II. Consequentemente, o mutante S573C-CFTR parece ser sensível à fosforilação pelo AMPK. Os nossos resultados mostram também que a S573C-CFTR é regulada por alterações no pH intracelular de uma forma diferente da wt-CFTR, o que sugere que este resíduo, localizado no NBD1 da CFTR, tem especial relevância na ligação ao ATP e abertura do canal iónico. Posteriormente, estudou-se o efeito da fosforilação do CK2 na função da CFTR. A inibição específica deste cinase por TBB (4,5,6,7 – tetrabromobenziotriazolo) resultou numa diminuição da função da wt-CFTR. No entanto, este composto não teve nenhum efeito na função da F508del-CFTR. Focámo-nos também o nosso estudo em três resíduos (S422, S511 e T1471), passíveis de fosforilação pelo CK2. Estes resíduos foram substituídos, por mutagénese dirigida, para resíduos de alanina (A) ou aspartato (D). A mutação do resíduo S511 quer para alanina quer para aspartato não teve nenhum efeito significativo na função da wt-CFTR. No entanto, a mutação do resíduo S422 para uma alanina diminuiu significativamente a função da wt-CFTR, enquanto que a mutação desta serina para aspartato a aumentou significativamente. Quanto ao resíduo T1471A, ambas as variantes produzidas são menos funcionais do que a wt-CFTR. Adicionalmente, os mutantes S422 e T1471 são inibidos pelo TBB, o que sugere que nenhum destes local é exclusivo para a fosforilação pelo CK2. No seu conjunto, estes dados sugerem que o CK2 pode ser um efector positivo da biogénese, tráfego e/ou função da CFTR. O nosso último objectivo foi estudar o efeito da fosforilação da CFTR pela SYK, mutando o único local de consensus encontrado na sequência da CFTR, o resíduo de tirosina na posição 512, para um resíduo de alanina (A), aspartato (D) ou fenilalanina (F). A mutação do resíduo Y512 quer para aspartato quer para fenilalanina não produziu qualquer efeito na activação da CFTR pelo cAMP. No entanto, ao mutar este resíduo para alanina vê-se um aumento significativo da actividade quer da wt-CFTR quer da F508del-CFTR, o que sugere que esta mutação seja responsável por uma mudança conformacional na proteína que favorece a abertura do canal iónico. No seu conjunto, estes resultado contribuem para a compreensão dos efeitos da fosforilação da CFTR por diferentes cinases, com o objectivo de alargar a perspectiva sobre os mecanismos que regulam este canal iónico, e desta forma aumentar o conhecimento acerca dos mecanismos moleculares que regulam o processamento, tráfego e função da proteína CFTR.
Description: Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2009
URI: http://hdl.handle.net/10451/3944
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