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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/4027

Título: Ammonia-oxidizing Archaea from high artic soils
Autor: Alves, Ricardo Jorge Eloy
Orientador: Urich, Tim
Tenreiro, Rogério Paulo de Andrade, 1955-
Palavras-chave: Microbiologia do solo
Alterações climáticas
Solos
Azoto
Carbono
Amonia
Região ártica
Teses de mestrado - 2011
Issue Date: 2011
Resumo: As regiões árcticas e boreais cobrem 22% da superfície terrestre e englobam toda uma variedade de ecossistemas particularmente sensíveis a alterações ambientais, entre ecossistemas terrestres (Chapin III et al., 2000; Sala et al., 2000). O Árctico está actualmente a sofrer alterações dramáticas, previstas de aumentar drasticamente durante o presente século em resultado do aumento das temperaturas que desproporcionalmente afecta estas regiões (IPCC, 2007). Alterações na estrutura e funcionamento destes ecossistemas têm um enorme impacto no clima, não só à escala local e regional, como também à escala global (Chapin III et al., 2000; Post et al., 2009). Adicionalmente, estimativas recentes indicam que a quantidade de carbono armazenado nos solos permafrost das regiões árcticas e boreais é duas vezes superior ao carbono presente na atmosfera e mais de três vezes superior a todo o carbono armazenado na totalidade da biomassa florestal, perfazendo 50% do carbono orgânico subterrâneo (Tarnocai et al., 2009; Kuhry et al., 2010). O aumento dos processos de decomposição e respiração em função do aumento das temperaturas está previsto constituir um importante feedback positivo do aquecimento global, através da libertação na atmosfera do carbono contido nestes reservatórios, incluindo aquele contido nas fracções mais recalcitrantes do solo (Biasi et al., 2005; Schuur et al., 2008 e 2009). A produtividade e respiração dos ecossistemas árcticos são geralmente limitadas pelo efeito conjunto das baixas temperaturas, reduzida disponibilidade de nutrientes e reduzidos inputs externos de nutrientes (Jonasson e Michelsen, 1996; Jonasson e Shaver, 1999). No entanto, foi demonstrado que o aumento das temperaturas leva à redução desta limitação através da estimulação dos processos de decomposição e mineralização, com consequente libertação de nutrientes armazenados na matéria orgânica do solo (Binkley et al., 1994; Mack et al., 2004; Biasi et al., 2008). Este fenómeno está previsto induzir um ciclo de feedbacks positivos na actividade microbiana, levando a desequilíbrios na reciclagem de nutrientes e, em última instância, exercendo extensas alterações no ciclo do carbono e no funcionamento geral dos ecossistemas árcticos, a curto e longo prazos (Shaver et al., 1992; Callaghan et al., 2004). O azoto é geralmente considerado o principal nutriente limitante em solos do Árctico (Shaver e Chapin III, 1980; Jonasson e Michelsen, 1996; Nordin et al., 2004) e a sua disponibilidade no ambiente depende sobretudo dos processos de decomposição e de transformação de compostos azotados catalisados por microrganismos (Canfield et al., 2010). Apesar da enorme diversidade taxonómica e funcional dos microrganismos envolvidos nestes processos, bem como do facto que a composição das comunidades microbianas afecta, e é afectada pelo funcionamento geral dos ecossistemas (Reed e Martiny, 2007; Strickland et al., 2009), as populações microbianas e o seu papel nos ciclos biogeoquímicos do Árctico permanecem virtualmente por caracterizar. Estudos recentes verificaram, de facto, variações espaciais e temporais nas comunidades microbianas nestas regiões (Neufeld e Mohn, 2005; Zak e Kling, 2006; Wallenstein et al., 2007; Chu et al., 2010; Schütte et al., 2010), bem como em função de aumentos na temperatura e na deposição de nutrientes (Campbell et al., 2010). Foram também efectuadas semelhantes observações relativamente a alguns grupos funcionais especificamente envolvidos no ciclo do azoto, nomeadamente variações nas populações de microrganismos fixadores de azoto (Deslippe et al., 2005; Deslippe e Egger, 2006; Walker et al., 2008) e de bactérias desnitrificantes (Walker et al., 2008). No entanto, outros grupos funcionais cruciais, tais como os responsáveis pela nitrificação, permanecem por caracterizar, apesar de este processo ter já sido extensamente documentado em solos do Árctico, sendo reconhecidamente dependente das condições ambientais (Booth et al., 2005). A nitrificação é um processo exclusivamente microbiano, consistindo na conversão sequencial da amónia (NH3) a nitrito (NO2-), por intermédio de microrganismos oxidantes de amónia, e subsequente conversão do NO2- a nitrato (NO3-), por microrganismos oxidantes de nitrito. Foi também demonstrado que este processo é responsável pelo consumo de cerca de metade da quantidade líquida de azoto mineralizado anualmente em solos do Árctico, chegando aos 100% em alguns anos (Giblin et al., 1991). Adicionalmente, o processo de nitrificação está, directa- e indirectamente, envolvido nas emissões do gás óxido nitroso (N2O) (Conrad, 1996), o qual possui um potencial enquanto gás do efeito estufa 300 vezes superior ao do dióxido de carbono (CO2), sendo considerado a principal substância responsável pela degradação da camada de ozono no séc. XXI (Ravishankara et al., 2009). Foi de facto demonstrado que a nitrificação contribui com a maior parte do N2O produzido em alguns solos, incluindo no Árctico, comparativamente ao processo canónico de desnitrificação (Ma et al., 2007; Siciliano et al., 2009). A oxidação da amónia é realizada tanto por bactérias como por árqueas, apesar da contribuição relativa destes grupos permanecer por esclarecer (Nicol e Schleper, 2006; Prosser e Nicol, 2008). Durante mais de um século, as bactérias oxidantes de amónia (AOB, ammonia-oxidizing bacteria) foram consideradas as principais responsáveis por este processo na natureza, embora recentemente tenha sido demonstrado que árqueas pertencentes ao novo filo Thaumarchaeota (Brochier-Armanet et al., 2008; Spang et al., 2010) podem deter um papel fundamental na nitrificação, dado possuírem genes que codificam o enzima amónia monooxigenase e dado estarem amplamente distribuídas, sendo extremamente abundantes em vários ambientes, por vezes ordens de magnitude mais abundantes que as AOB (Francis et al., 2005; Leininger et al., 2006; Wuchter et al., 2006; Caffrey et al., 2007; Lam et al., 2007). Enquanto várias propriedades fisiológicas e metabólicas foram já descritas nas AOB, apenas recentemente foi demonstrado que as árqueas oxidantes de amónia (AOA, ammonia-oxidizing archaea) são efectivamente capazes de oxidar amónia de forma autotrófica em diversos ambientes, tais como em ambientes marinhos (Könneke et al., 2005; Walker et al., 2010; Blainey et al., 2011), em fontes termais (de la Torre et al., 2008; Hatzenpichler et al., 2008) e em diversos solos (Offre et al., 2009 e 2011; Pratscher et al., 2011; Tourna et al., 2011; Xia et al., 2011; Zhang et al., 2011). Diversos estudos indicam que as AOA estão geralmente mais activas em ambientes oligotróficos e/ou com baixos níveis de pH, oxigénio e azoto (Lam et al., 2007; Nicol et al., 2008; Erguder et al., 2009; Di et al., 2009; Di et al., 2010; Gubry-Rangin et al., 2010; Molina et al., 2010; Verhamme et al., 2011). No entanto, a associação directa com estes factores ambientais e com um metabolismo autotrófico permanece restrita a poucas linhagens de AOA, apesar da diversidade taxonómica e ubiquidade das AOA sugerirem que estas possam deter um potencial metabólico e fisiológico muito mais vasto. De facto, foi demonstrado que a recentemente isolada taumárquea Nitrososphaera viennensis possui requerimentos nutricionais distintos, podendo inclusivamente ser cultivada sob concentrações de amónia relativamente elevadas, comparativamente às outras AOA caracterizadas (Tourna et al., 2011). Outras evidências sugerem ainda que algumas AOA podem de facto possuir metabolismos heterotróficos ou mixotróficos (Ingalls et al., 2006; Schleper e Nicol, 2011). A hipótese de que a ecologia e evolução das árqueas é conduzida pela sua adaptação a condições de stress energético crónico (Valentine, 2007) leva à sugestão de que os ecossistemas árcticos poderão constituir ambientes favoráveis às árqueas, dadas as condições resultantes das baixas temperaturas, reduzida disponibilidade de nutrientes, ciclos drásticos de congelamento-descongelamento e verões curtos intercalados por longos períodos com reduzida luz solar. De facto, a maioria das populações e diversidade das árqueas estão presentes em ambientes frios (Cavicchioli, 2006), nos quais árqueas pertencentes ao filo Thaumarchaeota, potencialmente capazes de oxidar amónia, estão amplamente distribuídos (Preston et al., 1996; Nicol et al., 2005; Koch et al., 2007; Nakagawa et al., 2007; Ayton et al., 2009; Kalanetra et al., 2009). Para mais, foram já identificadas grupos de Thaumarchaeota em solos da Sibéria (Ochsenreiter et al., 2003) e em solos permafrost do Árctico canadiano (Steven et al., 2007 e 2008), bem como outros grupos de árqueas relacionados com este filo detectados em solos de Svalbard (Høj et al., 2005, 2006 e 2008). Curiosamente, foram também identificadas taumárqueas em vários solos de tundra alpina, nos quais não foram detectadas AOB (Nemergut et al., 2008). Apesar da sugestão de que as AOA poderão estar geralmente presentes em solos sujeitos a baixas temperaturas, as regiões árcticas são, não obstante, extremamente heterogéneas, o que poderá ser reflectido nas comunidades microbianas presentes, inclusivamente nas comunidades de AOA. De facto, o Árctico engloba uma grande variedade de ecossistemas terrestres, os quais impõem variáveis pressões selectivas às populações de microrganismos presentes, em resultado das interacções entre vegetações distintas, processos de crioturbação e diferentes propriedades geo-físico-químicas do solo, frequentemente em reduzidas escalas espaciais. Com base no pressuposto de que os solos do Árctico poderão constituir ambientes favoráveis às árqueas e tendo em conta a importância fundamental dos processos responsáveis pela reciclagem do azoto nestes ecossistemas, o presente trabalho teve como objectivo a caracterização das comunidades de AOA em distintos solos do Árctico, relativamente às propriedades físico-químicas dos solos e ao potencial envolvimento das AOA no processo de nitrificação. Doze amostras de solo recolhidas principalmente em Spitsbergen (Svalbard), mas também em Tazovskiy (Sibéria) e em Zackenberg (Gronelândia), foram analisadas através de uma abordagem polifásica, com recurso a análises moleculares do gene amoA (que codifica a subunidade A da amónia monooxigenase; geralmente utilizado como marcador molecular de organismos oxidantes de amónia), determinação de taxas brutas de nitrificação através do método de diluição do isótopo 15N e culturas de enriquecimento de AOA em laboratório. Com base na análise filogenética da sequência aminoacídica traduzida a partir de genes amoA, foi observada uma extensa diversidade de AOA distribuída em vários solos de tundra distintos, ao contrário das AOB, as quais foram frequentemente indetectáveis. A diversidade de AOA identificada englobou a maioria das linhagens filogenéticas conhecidas, com predominância de grupos associados à vasta linhagem dominante em solos e sedimentos. Os seis grupos principais de AOA identificados estavam distribuídos entre os diferentes solos de acordo com o tipo de ecossistema (i.e. habitat), independentemente da localização geográfica, revelando também uma elevada especificidade local dos grupos individuais. Análises estatísticas multivariadas baseadas nas proporções relativas dos filotipos de AOA e num vasto conjunto de parâmetros ambientais mostraram que a composição das comunidades de AOA estava parcialmente associada ao conteúdo em azoto do solo, em particular ao NO3-, bem como às condições hídricas dos solos. No entanto, a separação geral entre populações distintas de AOA não pareceu estar unicamente associada a nenhuma das propriedades individuais dos solos, revelando uma relação aparentemente multifactorial entre as AOA e o ambiente, frequentemente em pequenas escalas filogenéticas e espaciais. A detecção de AOA em concomitância com taxas de nitrificação mensuráveis em solos onde as AOB estavam aparentemente ausentes, sugeriu que as AOA poderão ser efectivamente responsáveis pela oxidação da amónia implicada nesse processo. As diferentes taxas de nitrificação medidas nesses solos, onde aparentemente as AOA eram os procariotas oxidantes de amónia dominantes, sugeriram que as diferentes populações de AOA residentes diferem no seu potencial nitrificante, tanto sob as condições nativas de azoto no solo, como após adição de reduzidas quantidades de NH4+. Curiosamente, as diferentes populações residentes de AOA, dominadas por filotipos distintos, aparentaram estar associadas a diferentes taxas de nitrificação. As taxas de nitrificação mais elevadas foram detectadas em solos com elevado teor hídrico, onde as populações de AOA eram dominadas por filotipos associados a um grupo basal da linhagem predominante em solos/sedimentos, ou associados a um grupo previamente detectado em ambientes geotérmicos, pertencente à linhagem predominantemente marinha. As taxas de nitrificação foram geralmente mais baixas em solos com baixo teor hídrico, dominados pelo grupo de AOA mais abundante e amplamente distribuído em solos, independentemente da presença ou ausência de AOB. Estes resultados sugeriram, não só uma diferenciação dos nichos ocupados pelas AOA, como também uma baixa redundância funcional entre os diferentes grupos. Adicionalmente, a análise de inúmeras culturas de enriquecimento de AOA em laboratório, iniciadas a partir de diferentes solos de Spitsbergen, confirmou que as populações de AOA presentes, pelo menos em alguns solos de turfeira, tundra de musgos e de frost boils, são efectivamente capazes de oxidar amónia, em particular aquelas que incluíam membros de um grupo basal não-caracterizado da linhagem de solos/sedimentos, detectados quase exclusivamente nos locais de turfeira. De um modo geral, os resultados obtidos pelo presente estudo sugerem que os solos do Árctico podem ser colectivamente considerados enquanto ―hotspots‖ de diversidade de AOA, nos quais estes organismos podem deter um papel crucial no processo de nitrificação. Adicionalmente, várias indicações suportam a ideia de que a diversidade destes organismos pode, de facto, representar um potencial fisiológico e metabólico superior ao geralmente suposto, com diferentes grupos de AOA detendo papéis funcionais não-redundantes, nomeadamente no Árctico. Dada a importância da regulação do ciclo do azoto no funcionamento dos ecossistemas árcticos, estas observações enfatizam a necessidade de compreender a dinâmica das populações de AOA, bem como de outros grupos de microrganismos envolvidos nestes processos, sobretudo no âmbito das respostas destes ecossistemas a alterações climáticas.
Arctic ecosystems are of crucial importance for the climatic balance of the globe. Therefore basic knowledge about the microbial groups involved in their biogeochemical processes is required for a better understanding of their functioning and their responses to environmental changes. Nitrogen has been shown to be a major limiting nutrient for ecosystem productivity and respiration in Arctic soils and its availability is strongly regulated by nitrification, the biological conversion of ammonia to nitrate, via nitrite. Yet, the microbial communities involved in this process remain largely uncharacterized in Arctic soils, in particular the ammonia-oxidizing archaea (AOA), which have been recently found to be abundant and widespread in most other environments. The present study aimed at characterizing the AOA communities in several distinct Arctic tundra soils in relation to soil properties and potential role in nitrification. Twelve soils collected mainly from Spitsbergen (Svalbard) and also from Tazovskiy (Siberia) and Zackenberg (Greenland) were analysed through a polyphasic approach, coupling molecular analysis of the amoA gene (encoding subunit A of ammonia monooxygenase), determination of gross nitrification rates by a 15N pool dilution method and enrichment of archaeal nitrifiers in laboratory cultures. Based on phylogenetic analyses of amoA sequences, AOA were shown to be diverse and widespread throughout a variety of distinct tundra soils, in contrast to ammonia-oxidizing bacteria (AOB), which were often undetectable. The six identified clusters of AOA were distributed according to their habitat, independent of geographic location. Multivariate analyses showed that AOA distribution was partially associated with the nitrogen composition of the soil, particularly with nitrate. However, no single soil property could be directly associated with overall differences in AOA communities, which showed an apparent multifactorial association with the environment, often at small scales. In situ gross nitrification was measurable in all soils, with the highest rates detected in wet soils, namely in the two tundra fen sites and in a moss tundra site. The wet moss tundra soil was dominated by an AOA group affiliated with a geothermal cluster within the marine lineage, and in one of the tundra fen sites a basal AOA soil cluster co-occurred with AOB, while in the other fen site only AOB were detected. Nitrification activity was invariably lower in dryer soils dominated by typical soil AOA groups, regardless of co-detection of AOB. Gross nitrification rates measured in different soils where no AOB were detected showed that the distinct resident AOA populations differed in their potential to nitrify under in situ or low NH4+ amendment conditions. Furthermore, laboratory enrichment cultures with AOA indicated that archaeal populations from Arctic soils are capable of ammonia oxidation, in particular those affiliated with the soil cluster that dominated the fen peat soil. Together, these observations suggest that Arctic soils can be collectively regarded as “hotspots” of AOA diversity and that these organisms might harbour a greater physiological and niche versatility than generally assumed, possibly playing an important role in nitrification in Arctic terrestrial ecosystems.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011
URI: http://hdl.handle.net/10451/4027
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