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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/4029

Title: The role of calcium in Saccharomyces sp. response to ethanol stress
Authors: Duarte, Sofia de Oliveira Dias
Advisor: Monteiro, Gabriel António Amaro
Tenreiro, Ana Maria Moura Pires de Andrade, 1952-
Keywords: Microbiologia
Saccharomyces bayanus
Saccharomyces cerevisiae
Etanol
Cálcio
Teses de mestrado - 2011
Issue Date: 2011
Abstract: As leveduras das espécies Saccharomyces bayanus e S. cerevisiae são usadas em vários processos industriais, devido à sua capacidade fermentativa. Por isso, é importante que as leveduras sejam resistentes a elevadas concentrações de etanol, que é produzido pelas próprias durante a fermentação, de forma a que estes processos se tornem mais rentáveis. As leveduras da espécie S. cerevisiae possuem vários sistemas que estão envolvidos na sua adaptação e tolerância ao etanol, sendo que alguns estão associados a mecanismos gerais de resposta a stress, enquanto outros são específicos para o stress de etanol. Algumas destas respostas estão já bem caracterizadas, mas um estudo recente deixou algumas questões em aberto2. Mostrou que o etanol estimula a via da calcineurina/Crz1p, resultando numa tolerância a maiores concentrações de etanol. Mas, ficou por provar se, após o choque de etanol, existe um aumento da concentração de Ca2+ citosólico, e qual a sua origem2. Sendo assim, neste trabalho pretendeu-se contribuir com um conhecimento mais aprofundado acerca de como as leveduras respondem a um choque de etanol. O primeiro passo consistiu na optimização dum protocolo que permitisse a detecção de variações na concentração de Ca2+ citosólico. O indicador fluorescente Fluo-4 AM foi introduzido no interior das células de levedura, utilizando-se a técnica de electroporação. Uma vez no interior da célula, os grupos éster são clivados por esterases intracelulares e a forma sensível ao Ca2+ é libertada. Quando o Fluo-4 AM se liga ao Ca2+ livre no citosol, ocorre um aumento da fluorescência3,4, que é depois detectada por espectrofluorimetria. As condições de electroporação, nomeadamente a sua duração total (em número de milisegundos), voltagem e concentração de Fluo-4 AM utilizadas, foram optimizadas para ambas as espécies. No caso de S. bayanus, considerou-se que a melhor condição é a de 25 mseg de electroporação com 2500 V/cm, usando-se o Fluo-4 AM com uma diluição 1:2. No caso da estirpe tipo de S. cerevisiae a melhor condição é a de 10 mseg de electroporação com 2500 V/cm, sendo que o Fluo-4 AM deverá estar numa diluição de 1:8. Para as estirpes selvagem e mutantes de S. cerevisiae BY, a condição ideal de electroporação é de 25 mseg com 2500 V/cm, usando-se o Fluo-4 AM numa diluição 1:2. As condições consideradas óptimas foram posteriormente utilizadas nas restantes experiências. Uma das principais conclusões deste estudo foi que as leveduras S. bayanus e estirpe tipo de S. cerevisiae respondem ao choque de etanol com um aumento da concentração de Ca2+ citosólico. Esta resposta é ainda mais intensa em S. cerevisiae, provavelmente devido à sua menor resistência natural ao etanol. Cruzando estes resultados com informação proveniente de estudos anteriores, o aumento dos níveis de Ca2+ citosólico vai resultar na formação de complexos Ca2+/calmodulina, que irão activar a calcineurina. Por sua vez, quando activada, a calcineurina desfosforila o factor de transcrição Crz1p, resultando na sua rápida translocação para o núcleo, onde é responsável pela expressão de genes que induzem a tolerância ao etanol. Com base nos resultados obtidos para S. bayanus e estirpe tipo de S. cerevisiae, o Ca2+ envolvido nesta resposta parece ser proveniente principalmente dos reservatórios intracelulares (vacúolo). Mas, as experiências com as estirpes selvagem e mutantes de S. cerevisiae BY, apesar de confirmarem que as leveduras respondem ao choque de etanol com um aumento da concentração de Ca2+ citosólico, mostram ainda que o Ca2+ parece não só ser proveniente do vacúolo, mas também do meio extracelular. Coloca-se assim a hipótese de que o Ca2+ possa ter diferentes origens ao longo do processo de resposta ao choque de etanol, tal como já foi descrito para o stress hipotónico. Os valores de intensidade de fluorescência correspondem a uma determinada concentração de Ca2+ citosólico, que foi determinada usando um kit de calibração com soluções padrão de Ca2+ livre em concentrações definidas. Assim, foi possível comprovar que os valores obtidos estavam, no geral, dentro da gama de concentração de Ca2+ citosólico esperada para estas espécies de levedura. Outra experiência permitiu ter a certeza de que o etanol não estava a interagir inespecificamente com o Fluo-4 AM, o que poderia levar a artefactos nos resultados de fluorescência. O etanol só por si, não tem efeito na fluorescência emitida pelo Fluo-4 AM, sendo que para ser registado um aumento na fluorescência, tem de existir um aumento da concentração de Ca2+. Vários estudos já mostraram que leveduras pré-expostas a uma quantidade não letal de etanol podem activar mecanismos de resposta ao stress que resulta numa resistência transiente a maiores concentrações de etanol1. Por essa razão, outro objectivo deste estudo consistia em investigar se o crescimento de ambas as espécies na presença de diferentes concentrações de etanol teria alguma influência no posterior aumento da concentração de Ca2+ citosólico, em resposta a um choque de etanol. No caso de S. bayanus, o crescimento na presença de 0, 3 ou 9% etanol (v/v) resultou em padrões de resposta semelhantes. Os resultados da estirpe tipo de S. cerevisiae mostram que, após crescimento com 3% de etanol no meio de cultura, parecem responder duma forma mais intensa ao choque de etanol, do que células que cresceram sem etanol. Em S. bayanus e na estirpe tipo de S. cerevisiae, o etanol parecia actuar como um agonista do GPCR (G-protein coupled receptor) de detecção da glucose. Assim, os aumentos da concentração de Ca2+ citosólico detectados anteriormente neste estudo, poderiam dever-se à activação deste GPCR pelo etanol. Os resultados também sugerem que o etanol provavelmente pode actuar por uma via alternativa, além do GPCR, pela qual também promove o aumento da concentração de Ca2+ citosólico nestas espécies de levedura. Mas, os resultados obtidos com as estirpes selvagem e mutantes de S. cerevisiae BY mostraram que afinal o etanol não está a actuar pelo GPCR de detecção da glucose, nem pelo GPCR de detecção de feromonas, porque a delecção dos genes de cada GPCR não eliminou o aumento da concentração de Ca2+ citosólico em resposta ao choque de etanol. Sendo assim, o etanol estará a actuar por uma via alternativa, que irá promover o aumento da concentração de Ca2+ citosólico nas leveduras. Cerca de 30-40% de todas as drogas prescritas funcionam como agonistas ou antagonistas de GPCRs, e a maior parte dos GPCRs humanos são órfãos, ou seja, os seus ligandos ainda não são conhecidos. Portanto, esta é uma área actualmente muito promissora, pois estes receptores órfãos podem ser alvos para o desenvolvimento de novas drogas. Apesar do etanol não parecer funcionar como agonista de nenhum GPCR destas espécies de levedura, o protocolo optimizado poderá ter aplicação em sistemas de detecção de fluorescência baseados em microchips, com o objectivo de acelerar e facilitar a detecção de novos agonistas e antagonistas de GPCRs. Inicialmente, tendo por base este protocolo, as leveduras podem ser utilizadas como controlo, para optimizar todo o sistema. Mas, no futuro, poderiam-se expressar GPCRs de mamíferos em leveduras, sendo para isso necessário substituir os GPCRs da via das feromonas, pelos GPCRs pretendidos. Após modificações nas proteínas G e também no sistema de output, será possível testar rapidamente bibliotecas de ligandos, de forma a detectar quais activam determinado GPCR órfão. A utilização de leveduras em vez das células animais tem algumas vantagens, pois as primeiras são fáceis de crescer e manipular geneticamente, os custos envolvidos são baixos e são bastante mais resistentes.
Saccharomyces bayanus and S. cerevisiae are used in several industrial processes, mainly for their fermentation ability. It’s important that yeasts can resist to high ethanol concentrations, produced during fermentation, in order to make these processes more profitable. This work tried to contribute with a more detailed knowledge about how yeasts respond to an ethanol shock. One of the main conclusions was that both species respond to ethanol shock with an increase of cytosolic Ca2+ concentration, and this response is stronger in S. cerevisiae neotype strain. During this response, Ca2+ seems to come from extracellular media and intracellular stores. Crossing with previous studies results, the rise of cytosolic Ca2+ levels will result in the formation of Ca2+/calmodulin complexes that will activate calcineurin. When activated, calcineurin dephosphorylates the transcription factor Crz1p, causing its translocation to the nucleus, where it's responsible for the expression of genes that induce tolerance to ethanol2. Other main objective was to investigate if growing both species in the presence of ethanol had some influence in the following increase of cytosolic Ca2+ concentration, in response to an ethanol shock. For S. bayanus, growth with 0, 3 or 9% ethanol leads to similar patterns, probably because the strain used in this study was naturally more resistant to ethanol. The results for S. cerevisiae neotype strain show that cells grown with 3% ethanol seem to respond in a more intense way to the ethanol shock, than cells grown without ethanol. The experiments with S. cerevisiae BY wild type and deletion strains showed that ethanol wasn't acting through glucose-sensing or pheromone signaling GPCRs, but through an alternative pathway, to promote an increase of cytosolic Ca2+ concentration in yeasts.
Description: Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011
URI: http://hdl.handle.net/10451/4029
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