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Title: Selecção e caracterização de anticorpos de domínio único específicos para a proteína gp41 de VIH-1
Authors: Lourenço, Sara Ferreira Llorente Grancho, 1981-
Advisor: Valadas, Emília, 1962-
Silva, Frederico Nuno Castanheira Aires da, 1974-
Keywords: Doenças transmissíveis emergentes
Doenças sexualmente transmissíveis
HIV-1
Proteína GP41 do envelope de HIV
Anti-retrovirais
Antígenos CD4
Terapêutica
Teses de mestrado - 2011
Issue Date: 2011
Abstract: A Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA) é uma patologia imunossupressora cujos agentes etiológicos são os Vírus da Imunodeficiência Humana tipo-1 e tipo-2 (VIH-1 e VIH-2), ambos retrovírus pertencentes à família dos lentivírus. Esta patologia reflecte a fase final da infecção por VIH, quando o sistema imune do indivíduo infectado se encontra gravemente afectado, perdendo a capacidade de defesa contra agentes estranhos. Segundo dados da Organização Mundial de Saúde (OMS), estima-se que cerca de 36 milhões de pessoas se encontrem infectadas por VIH e que aproximadamente 20 milhões já morreram devido à doença, originando um número, com tendência crescente, de 56 milhões de pessoas até 2012. Nos últimos anos ocorreram avanços significativos no tratamento da infecção por VIH e SIDA. A aplicação de combinações de agentes anti-retrovíricos levou, em muitos casos, a um declínio substancial na incidência da SIDA e da mortalidade associada nos países desenvolvidos. No entanto, o desenvolvimento de resistências virais aos fármacos utilizados tem-se tornado uma enorme barreira, tendo vindo a aumentar a percentagem de indivíduos infectados por VIH-1 que possuem vírus resistentes a pelo menos uma medicação anti-retrovírica. Novas terapias e outros alvos mais promissores necessitam surgir rapidamente, com o objectivo de combater as formas mais resistentes de VIH que já circulam pelo mundo. Neste contexto, este trabalho teve como objectivo seleccionar anticorpos de domínio único específicos para a proteína transmembranar gp41 de VIH-1, a partir de uma biblioteca naïve de anticorpos VL de coelho. Estes anticorpos pelas suas reduzidas dimensões podem ter a capacidade de se ligar mais facilmente a regiões pouco acessíveis da proteína gp41 e bloquear assim o processo de fusão e impedir a entrada do vírus na célula hospedeira. Para tal, construiu-se uma biblioteca naïve de anticorpos VL de coelho e seleccionou-se uma pool de anticorpos específicos para a proteína gp41 e domínio HR1 por phage display. A partir desta pool de anticorpos seleccionaram-se quatro clones diferentes que apresentaram elevados níveis de expressão e especificidade para as moléculas alvo. Ensaios celulares foram realizados com o objectivo de analisar a capacidade de inibição da fusão do envelope viral com o receptor CD4 mediada pelos VLs. Os anticorpos identificados demonstraram ter a capacidade de inibir a fusão envelope/CD4 sendo esta inibição dependente da concentração de anticorpo presente. Estes resultados sugerem assim que estes anticorpos poderão ser uma abordagem bastante promissora para o desenvolvimento de novas moléculas na terapêutica anti-retrovírica. Por outro lado, podem também ser utilizados como “ferramentas” no estudo conformacional da proteína gp41, no seu mapeamento e estudo do processo de fusão. Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) is an immunosupressor disease whose etiological agents are Human Immunodeficiency Virus type 1 and 2 (HIV-1 and HIV-2). Both are retrovirus, belonging to lentivirus family. AIDS is the late stage of HIV infection, when the immune system is severely damaged and has difficulty fighting diseases and certain cancers. World Health Organization (WHO) estimates that 36 million people are infected with HIV and approximately 20 million individuals have died from AIDS. In the last years, the most significant progress in the battle against HIV/AIDS has been the development of therapy strategies based on the combination of different antiretroviral drugs, also known as Highly Active Antiretroviral Therapy (HAART), that provide important treatment options and the increasing of life-time for HIV infected patients. Antiretroviral therapy has led to an increase of life-time and a significant decrease in mortality associated with infection by HIV. In spite of the significant advances in the antiretroviral therapy, drug resistance has become a serious problem. The number of people infected with HIV-1 with resistance to, at least, one antiretroviral drug, is increasing. It seems to be impossible to eradicate HIV/AIDS with actual antiretroviral therapy strategies. New targets, new drugs and novel antiretroviral therapy strategies are necessary to stop the emergence of HIV-1 drug resistant strains that exist all over the world. The main goal of this project was the selection of specific single domain antibodies from a naïve library against gp41 that could inhibit the HIV-1 infection process, by binding to inaccessible sites of gp41. To achieve this goal, a naïve antibody library was constructed and a pool of VL antibodies specific for gp41 and HR1 were selected by phage display. From these, four different antibodies were chosen that showed the best values of expression and binding to target molecules. Cellular assays were performed to verify the ability to inhibit the fusion process of the viral envelope with CD4 by VLs. The selected antibodies have the ability to inhibit the fusion process between HIV-1 envelope and CD4, being the inhibition dependent on the concentration of antibody present. These antibodies may, eventually, be applied to antiretroviral therapy and to the conformational study of gp41, in its mapping, and to the study of the fusion process.
Description: Tese de mestrado, Doenças Infecciosas Emergentes, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2011
URI: http://hdl.handle.net/10451/4175
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