Universidade de Lisboa Repositório da Universidade de Lisboa

Repositório da Universidade de Lisboa >
Faculdade de Ciências (FC) >
FC - Dissertações de Mestrado >

Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/4488

Title: Modulation of neuronal maturation: influence of neurotrophic factors and neuromodulators
Authors: Ribeiro, Ana Filipa Ferreira da Cunha
Advisor: Sebastião, Ana Maria, 1958-
Lima, Pedro A.
Keywords: Adenosine
A2AR
Crosstalk
Neuronal maturation
Teses de mestrado - 2010
Issue Date: 2010
Abstract: O cérebro é uma estrutura complexa formada por inúmeras células com diversas formas e funções, nomeadamente neurónios e células da glia, que incluem astrócitos, oligodendrócitos e microglia. No caso dos neurónios, estes divergem num grande número de subtipos, com base em características moleculares, morfológicas e electrofisiológicas. São células especializadas na transmissão e integração da informação, sendo que para tal, a sua morfologia é essencial. Para além do corpo celular, são normalmente formados por dois tipos diferentes de processos especializados, inúmeras dendrites, que recebem e levam a informação para o corpo celular, e um único axónio, que leva a informação para fora do corpo celular. Deste modo, o desenvolvimento de uma morfologia especializada e a expressão de moléculas específicas durante a diferenciação e maturação neuronal, constituem eventos essenciais à formação de neurónios maduros funcionais. O ambiente neural influencia grandemente a diferenciação. Os neurónios em diferenciação e maturação estão sujeitos à acção do meio envolvente, de moléculas sinalizadoras, as chamadas “pistas de orientação” (do inglês, signalling cues), que são libertadas pelas células vizinhas, induzindo alterações morfológicas nos primeiros. A existência de estruturas especializadas nas extremidades dos processos em desenvolvimento, os cones de crescimento, a partir dos quais os processos crescem, é fundamental para conduzir os processos em crescimento para um local específico, em resposta às pistas de orientação no meio extracelular, de modo a estabelecer contactos com outros neurónios. Deste modo, a maior alteração nas células nervosas durante o seu desenvolvimento é o crescimento extensivo de axónios e dendrites, bem como a proliferação de sinapses. Um exemplo conhecido de uma molécula sinalizadora que influencia a diferenciação e maturação neuronal é o factor neurotrófico derivado do cérebro, BDNF (do inglês, brain-derived neurotrophic factor). As suas acções estendem-se também à sobrevivência neuronal, bem como à modulação da transmissão e plasticidade sináptica. Para executar estas acções, o BDNF liga-se a dois tipos de receptores, nomeadamente aos receptores de alta afinidade de tirosina cinase, TrkB (do inglês, tropomyosin-related kinase B), e aos receptores de baixa afinidade, pertencentes à superfamília dos receptores do factor de necrose tumoral, p75NTR (do inglês, p75 neurotrophin receptor). A nível da maturação neuronal, o BDNF dá origem a alterações estruturais na célula, tais como a indução de dendrites primárias e arborização axonal e dendrítica, uma acção que envolve activação de cascatas de sinalização, como as vias das cinases PI3K (do inglês, phosphatidylinositol 3-kinase), a MAPK (do inglês, mitogen-activated protein kinase) e, com menor importância, a PLCγ (do inglês, phospholipase Cγ) A adenosina é um neuromodulador do sistema nervoso central, partilhando com o BDNF funções moduladoras da actividade sináptica. É o caso da facilitação das acções sinápticas do BDNF através da co-activação dos receptores A2A da adenosina, os quais estão acoplados à formação de cAMP, com consequente activação da proteína cinase A (PKA, do inglês, protein kinase A). Dada esta interacção entre ambos receptores, foi colocada a hipótese de que a adenosina, por activação dos receptores A2A, influencia as acções tróficas do BDNF na maturação neuronal. O objectivo do trabalho descrito nesta tese foi avaliar se os receptores A2A da adenosina modulam as acções tróficas do BDNF na maturação neuronal. Para além disso, também foi estudada a importância da adenosina endógena na activação dos receptores A2A e TrkB. Finalmente, foram exploradas as potenciais vias de sinalização associadas às acções tróficas dos receptores A2A na maturação neuronal. Para tal, recorreu-se à utilização de um software de medição de características morfológicas, HCA-Vision, o qual, a partir de uma imagem de um neurónio obtida por microscopia de fluorescência, cria um neurónio virtual, através do qual é possível realizar medições morfométricas, tais como o comprimento total das neurites e da neurite máxima, bem como o número de neurites primárias e de pontos de ramificação. Ao terceiro dia de cultura, neurónios corticais foram pré-incubados na presença ou ausência do agonista selectivo dos receptores A2A da adenosina, CGS 21680 (10nM), e/ou do antagonista desse receptor, ZM 241385 (50nM), sendo 20 minutos depois incubados com BDNF (20ng/mL). As culturas ficaram a incubar a 37˚C numa atmosfera humidificada com 5% CO2, com os ligandos anteriormente descritos até serem fixadas ao sétimo dia. Através da técnica de imunocitoquímica, os neurónios foram marcados para a proteína de ligação aos microtúbulos MAP2 (do inglês, microtubule-associated protein 2), com um fluoróforo conjugado com um anticorpo anti-MAP2, e o núcleo celular, com o marcador nuclear DAPI, que se liga ao DNA (do inglês, deoxyribonucleic acid). Observou-se que, tanto o BDNF como a activação dos receptores A2A da adenosina modulam a morfogénese neuronal, no entanto com efeitos distintos. O BDNF induz a formação de dendrites primárias, enquanto que a activação dos receptores da adenosina promovem um crescimento da neurite máxima. Para além disso, ambos induziram um aumento do número de pontos de ramificação. No caso da formação de dendrites primárias, estas mostraram ser independentes da activação dos receptores A2A da adenosina, contudo, os resultados obtidos levam a sugerir uma possível modulação deste receptor nos efeitos do BDNF na arborização dendrítica. Para além disso, a utilização de um antagonista selectivo para o receptor A2A permitiu observar uma diminuição do tamanho da neurite máxima e número de pontos de ramificação na ausência de ligandos activadores dos receptores em estudo, sugerindo uma actividade basal dos receptores A2A com consequências para a maturação neuronal. Para além disso, dado que no meio extracelular existem sempre quantidades consideráveis de adenosina, que é libertada tanto por neurónios como por células da glia, ou mesmo sintetizada extracelularmente por acção de ectoenzimas, fui explorar se a adenosina endógena, presente no meio de cultura, seria importante nos efeitos tónicos e basais dos receptores A2A e TrkB. Para tal, neurónios corticais em cultura foram tratados com adenosina desaminase (ADA, do inglês adenosine deaminase) 1h antes da adição dos ligandos dos receptores TrkB e A2A. Estes ficaram a incubar até serem fixados ao sétimo dia de cultura, sendo de seguida marcados para o MAP2 e núcleo. A remoção da adenosina endógena do meio extracelular pela utilização de ADA, não afectou a acção dos receptores A2A, no entanto atenuou o efeito do BDNF no aumento do número de pontos de ramificação e de neurites primárias. No primeiro caso, apesar de se já ter observado uma activação tónica dos receptores A2A (resultados com o antagonista A2A), a ausência de efeito aquando da remoção da adenosina endógena, sugere a presença de um outro receptor de adenosina com uma função oposta à dos A2A. No caso do BDNF, a atenuação dos seus efeitos na maturação neuronal pela remoção da adenosina extracelular, mas não pelo antagonista A2A, sugere novamente o envolvimento de um outro receptor de adenosina. Finalmente, foi-se explorar as vias de sinalização activadas aquando das acções tróficas dos receptores A2A da adenosina na maturação neuronal. Para tal, experiências com inibidores farmacológicos foram realizadas ao terceiro dia de cultura. As vias de sinalização PI3K, MAPK, PLCγ e PKA foram bloqueadas através da incubação de neurónios corticais com, respectivamente, os inibidores LY294002 (50μM), U0126 (10μM), U73122 (5μM) e Rp-cAMPS (100μM), os quais foram adicionados 30 minutos antes da adição do agonista dos receptores A2A, permanecendo durante mais 5h em contacto com as células. Observou-se que o crescimento da neurite máxima, promovido pela activação dos receptores A2A, foi completamente prevenido pelo bloqueio das vias de sinalização PI3K e MAPK e PLCγ; por outro lado, o aumento do número de pontos de ramificação por activação dos receptores A2A foi prevenido pelo bloqueio da PI3K, MAPK e PKA. Em conclusão, os resultados deste trabalho demonstram que tanto a activação dos receptores TrkB e A2A têm efeitos na maturação neuronal. Enquanto o primeiro promove a formação de dendrites primárias, o segundo promove o crescimento da neurite máxima, sendo que ambos apresentam uma acção coincidente na arborização dendrítica. Em estádios mais precoces da diferenciação neuronal, parece haver uma independência entre as acções tróficas do BDNF e as dos receptores A2A da adenosina, pois o aumento do número de dendrites primárias induzido pelo BDNF não é modulado pela activação, nem pela inibição, dos receptores A2A da adenosina. No entanto, ao longo do processo de maturação neuronal, as funções do BDNF parecem começar a ser moduladas pelo receptor A2A, como é o caso da arborização dendrítica. Para além disso, apesar da formação de neurites primárias não ser modulada pelo receptor A2A, parece ser modulada por um outro receptor de adenosina, tal como os restantes parâmetros morfológicos estudados. Finalmente, a acção trófica da adenosina, via activação dos receptores A2A, no crescimento da neurite máxima e na arborização dendrítica, mostrou ser dependente das vias de sinalização PI3K, MAPK, sendo a primeira também dependente da PLCγ e a segunda da PKA.
BDNF is known to induce the formation of primary dendrites in cortical neurons via PI3K and MAPK pathways. Adenosine, through A2A receptors (A2ARs), facilitates BDNF synaptic actions, but it is not known if this extends to BDNF influence upon neuronal maturation. Since the effects of BDNF are dependent on cAMP formation and A2ARs are coupled to the AC/cAMP transducing system, I tested the hypothesis that adenosine, through A2AR activation, was able to modulate BDNF actions upon neuronal maturation. E18 forebrain neurons from Sprague-Dawley rats were seeded at 104cells/cm2, and treated, at DIC 3, with CGS21680 (10-100nM) and/or ZM241385 (50nM) 20 minutes before BDNF (20ng/mL), remaining there until DIC 7. Cells stained with anti-MAP2 and DAPI were analysed by HCA-Vision software in terms of maximal neurite length and number of roots and branch points. The A2AR agonist, CGS21680, increased maximal neurite length, and the number of branch points in a concentration-dependent manner, with maximal effect at 30nM. BDNF increased the number of roots and branch points. The effect of BDNF upon neuronal branching was modified by CGS21680 or by ZM241385. The effects of BDNF upon the number of roots were not influenced by CGS21680, but it was attenuated by endogenous adenosine removal with adenosine deaminase. To address the signalling pathways activated by A2AR upon neuronal maturation, neurons were treated, at DIC 3, with inhibitors of PI3K, MAPK, PLCγ and PKA signalling pathways 30 minutes before the addition of CGS21680, which remained in the medium for 5h until fixation. The effects of the A2AR agonist were totally prevented by blocking PI3K and MAPK pathways; blocking PLCγ prevented the influence of the A2AR agonist upon maximal neurite elongation, whereas PKA blockade prevented its influence upon dendritic branching. These results suggest that A2ARs are involved in neurite elongation, while BDNF influences new primary dendrites formation, being that both receptors operate independently at early stages of neuronal maturation. However, they seem to crosstalk at later stages. Endogenous adenosine seems to influence BDNF-induced formation of roots, a process that might involve other adenosine receptors. Finally, the signalling pathways involved in the A2AR Abstract x actions upon neural maturation require PI3K, MAPK and PLCγ signalling pathways for maximal neurite elongation and PI3K, MAPK and PKA for branching.
Description: Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010
URI: http://hdl.handle.net/10451/4488
Appears in Collections:FC - Dissertações de Mestrado

Files in This Item:

File Description SizeFormat
ulfc055973_tm_ Ana_Ribeiro.pdf1.76 MBAdobe PDFView/Open
Statistics
FacebookTwitterDeliciousLinkedInDiggGoogle BookmarksMySpaceOrkut
Formato BibTex mendeley Endnote Logotipo do DeGóis 

Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.

 

  © Universidade de Lisboa / SIBUL
Alameda da Universidade | Cidade Universitária | 1649-004 Lisboa | Portugal
Tel. +351 217967624 | Fax +351 217933624 | repositorio@reitoria.ul.pt - Feedback - Statistics
DeGóis
  Estamos no RCAAP Governo Português separator Ministério da Educação e Ciência   Fundação para a Ciência e a Tecnologia

Financiado por:

POS_C UE