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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/4534

Title: Dynamic of the X chromosome inactivation in humans
Authors: Fernandes, Maria Miguel Gomes, 1987-
Advisor: Lopes, Susana M. Chuva de Sousa
Pereira, Maria João Colares, 1952-
Keywords: Determinação sexual
Cromossoma X
Expressão génica
Humanos
Teses de mestrado - 2011
Issue Date: 2011
Abstract: X Chromosome Inactivation appeared as a mechanism to overcome gene dosage imbalance between males and females. The emergence of sex chromosomes and the continuous loss of genes by the Y during evolution created a situation where many X-linked genes are now present in one copy in the male genome and in two copies in the female genome. The solution that mammals found was to inactivate the extra X in the females. This inactivation is paternally imprinted in marsupials. Mice show the two forms of XCI: initially imprinted at the four cells stage, then in the embryo proper reactivation occurs followed by a new wave of random inactivation, while the imprinted form is maintained in the trophoblast, so in the extra-embryonic tissues of the mouse the inactivated X is always the paternal one. If the imprinted form also occurs in humans as been an intense debate among researchers, with contradictory results in several reports. Here, we analyzed several extra-embryonic tissues from different human samples from the first trimester of development using HUMARA assay and parental specific transcription analysis and the results pointed to a random inactivation at the stages analyzed. The inactivation process, in mice, starts at the Xic (X inactivation center) where the Xist transcripts spread in cis from their site of synthesis to coat the entire chromosome. The coating starts in this spot and then progressively covers the entire chromosome, being the genes closer to Xic the ones to be inactivated first. Again, little is known about this dynamics in humans. The use of hES cell lines is of high interest as these cells recapitulate XCI in vitro if initially XaXa. Studying the expression levels of several X-linked chromosomes during hESC differentiation can give us some insights about this kinetic, and on the other hand, the state of XCI can help evaluate the pluripotency state of the lines. We used two hESC lines, a male and female, on D0 and D7 of differentiation to access XCI and pluripotency. The results suggested that the cells after D7 were not completely differentiated or that they might be initially at a semi-differentiated state as some genes behaved as we would expect if they were initially XaXa and others if they were XaXi. On the other hand, the derivation of hEG lines was also a goal, as the PGCs while migrating to the gonadal ridges suffer a series of epigenetic changes, including X reactivation. The derivation and study of these lines would help us clear some aspects about the dynamics of XCI and reactivation. Several studies report the derivation of hEGs, but with low rates of efficiency associated with instability in culture and poorly chemical defined conditions in feeder-layers. Taking advantage of the definition of a ground state medium we derived one line maintained in feeder-free culture and defined conditions, which ended up being inconclusive respecting the XCI, as it was a male embryo. Though, we aim to continue the derivation of hEGs in future experiments.
Existem diversas formas de determinação sexual no Reino Animal, variando desde determinação por factores ambientais, como por exemplo a temperatura de incubação dos ovos em crocodilos e outros répteis, passando por mecanismos baseados na constituição cromossómica que define os sexos no momento da fertilização, como nas aves e mamíferos onde os sexos são determinados por um par de cromossomas sexuais. Nas aves, as fêmeas são o denominado sexo heterogamético, pois definem-se por terem dois cromossomas sexuais diferentes (ZW), e os machos o sexo homogamético (ZZ). Em mamíferos a situação é a inversa, as fêmeas são o sexo homogamético (XX) e os machos o heterogamético (XY). O aparecimento destes métodos de determinação sexual trouxe vantagens evolutivas na medida em que em nada o clima poderia influenciar a razão entre machos e fêmeas na espécie. Contudo originou um problema de compensação de dosagem, já que, por um lado, as fêmeas possuem duas cópias de genes ligados ao X em comparação com apenas uma cópia nos machos e, por outro lado, genes localizados nos autossomas são maioritariamente expressos em dose dupla quando comparados com a cópia única dos genes localizados nos cromossomas sexuais, nos machos. A inactivação do cromossoma X surgiu portanto como um meio para resolver esta questão. A inactivação do X é imprintada em marsupiais, sendo o cromossoma paterno (Xp) preferencialmente silenciado. Em ratinho, a inactivação do X é estabelecida na fase de duas células, sendo também imprintada. Mais tarde, na massa celular interna, ocorre reactivação (E3.5) do Xp seguida de uma nova vaga de inactivação (E4.5), desta vez aleatória. Nas células do trophoblasto a inactivação mantém-se imprintada. A reactivação/inactivação do X nas células da massa celular interna é recapitulada in vitro pelas células estaminais embrionárias derivadas desta fase de desenvolvimento. Pouco se sabe sobre este processo em humanos e a inactivação imprintada do X tem sido alvo de intenso debate dentro da comunidade científica, com vários estudos a obter a conclusões contraditórias, devido à mistura de tecidos que constituem a placenta (trophoectoderme e mesoderme). Com este trabalho, tivemos acesso a material proveniente de clínicas de aborto, tanto aos tecidos embrionários em si, como aos variados tecidos extra-embrionários. O material recolhido era predominantemente do primeiro trimestre de desenvolvimento. O estudo realizado deu-nos claras evidências de que a inactivação do X em humanos é aleatória, pois nas amostras de placenta e de outros tecidos extra-embrionários (como o córion, amnios e cordão umbilical) observámos expressão tanto do cromossoma X materno como paterno. A inactivação aleatória do cromossoma X é regulada por uma região localizada no braço grande do cromossoma (Xq13) denominada centro de inactivação do X. Esta região é constituída por uma série de elementos genéticos que produzem longos RNAs não codificantes (ncRNAs) tais como Xist, Tsix, Xite, DxPas34 e Jpx/Enox. De entre estes destacam-se o Xist e Tsix pela sua importância em todo o processo. Em ratinho, sabe-se que o Xist começa a ser transcrito no futuro X inactivo (Xi) e que se espalha em cis a partir do seu ponto de transcrição para cobrir todo o cromossoma progressivamente, tornando-o inacessível a factores de transcrição. Por outro lado, no X activo (Xa) a manutenção da expressão de Tsix impede a transcrição do Xist e consequentemente, previne o silenciamento. O silenciamento genético é mantido e reforçado através do recrutamento de de novo metiltransferases e pela metilação especifica de histonas (H3K27; H3K9; H4K20) e do DNA, especificamente em ilhas CpGs ao longo do cromossoma. Como já foi referido, a inactivação do X é recapitulada durante a diferenciação de células estaminais embrionárias, em ratinho e nalgumas linhas celulares humanas. A possível ligação entre a inactivação do X e a expressão de genes ligados à pluripotência é de elevado interesse e pode ajudar-nos a compreender um pouco melhor a dinâmica da inactivação. Do mesmo modo, o estado da inactivação do X nas células poderá ser mais um meio para caracterizar e avaliar as linhas celulares de acordo com o seu nível de pluripotência e capacidade de diferenciação para futuras aplicações clínicas. Neste projecto pretendemos desenvolver um protocolo para o estudo da origem parental da expressão de uma série de genes ligados ao X. Inicialmente escolhemos uma série de 11 genes distribuídos ao longo do cromossoma cujos SNPs (single nucleotide polimorphisms) tinham sido previamente descritos na literatura. Ao genotipar e analisar a expressão dos genes e dos alelos ao longo da diferenciação de hESC pretendemos clarificar a nossa visão sobre a dinâmica e cinética deste processo, desde o início da expressão do Xist até ao total silenciamento do cromossoma. Por sua vez, acreditamos que este método poderá ser usado para avaliar o estado da inactivação do X em linhas celulares estaminais, de modo a avaliar o seu potencial. Para tal, usámos duas linhas diferentes de células estaminais embrionárias humanas, h2241 e h2258, uma feminina e a outra masculina, respectivamente. Avaliou-se a expressão dos genes ligados ao X e de genes associados à pluripotência em material não-diferenciado (D0) e material diferenciado (D7) através de RT-PCR quantitativo. O acesso a material feminino e masculino foi de igual modo uma boa oportunidade para poder avaliar a questão da compensação de dosagem entre machos e fêmeas. Segundo os nossos dados, ao fim de 7 dias as células analisadas ainda não estavam suficientemente diferenciadas, embora se registasse já um decréscimo na expressão dos genes ligados à pluripotência e de certos genes ligados ao X, tendo 4 dos genes analisados mostrado um comportamento semelhante ao que seria de esperar aquando da diferenciação de células XaXa para XaXi. As células primordiais germinativas (PGCs), que vão dar origem aos gâmetas, têm sido vistas com grande interesse para aplicações clínicas, em paralelo com as células estaminais embrionárias. Isto porque, ao longo da sua jornada desde o seu local de determinação até às gónadas, estas células sofrem uma série de remodelações epigenéticas, incluindo a reactivação do X e o “reset” dos imprintings. A derivação em cultura de linhas celulares a partir destas células (EGs) tem um grande interesse não só devido ao seu potencial clínico, já que os problemas associados a genes imprintados são ultrapassados, mas, também, como um meio de estudar a inactivação/reactivação do cromossoma X. Outro objectivo deste trabalho foi exactamente a derivação de linhas celulares a partir de PGCs, já que o acesso a material de aborto do primeiro trimestre também permite o isolamento das respectivas gónadas. Contudo, esta derivação tem-se mostrado difícil, já que outros grupos que se debruçaram sobre este tema registaram dificuldades em manter a estabilidade das culturas, sendo em geral os métodos de derivação muito pouco eficientes. A definição de um meio (N2B27+LIF+2i) que permite manter as células de ratinho em cultura no seu estado mais naive e sem o recurso a feeders, denominado de ground state, poderá ajudar-nos a estabelecer culturas de EGs tanto de ratinho como humanas. Das 11 gónadas que foram colocadas inicialmente em cultura, em apenas um caso registámos o aparecimento de colónias. Em experiências posteriores, onde experimentámos diferentes condições iniciais de cultura, ora introduzindo ou retirando os inibidores em diferentes timings, observámos o crescimento de pequenas colónias. Contudo não foi possível prosseguir com a experiência dado que não tinhamos no momento nenhuma linha de feeders em cultura.
Description: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011
URI: http://hdl.handle.net/10451/4534
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