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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/4539

Título: The role of Hippo pathway in Zebrafish (Danio rerio) caudal fin regeneration
Autor: Brito, Gonçalo Miguel, 1988-
Orientador: Jacinto, António, 1965-
Thorsteinsdóttir, Sólveig, 1962-
Palavras-chave: Biologia do desenvolvimento
Peixe-zebra
Danio rerio
Regeneração
Via Hippo
Teses de mestrado - 2011
Issue Date: 2011
Resumo: O crescimento dos tecidos e um dos processos fundamentais que contribuem para o desenvolvimento embrionário, no entanto, e apesar da sua importância, pouco se sabe acerca dos mecanismos que determinam o tamanho dos órgãos e consequentemente do organismo, uma das questões clássicas da Biologia do Desenvolvimento. Em particular, como e que as células desencadeiam os mecanismos adequados que asseguram as proporções certas e que resultam num tamanho final determinado com precisão? O controlo do tamanho dos tecidos/órgãos e um processo altamente coordenado e complexo que envolve diferentes mecanismos em resposta a sinais fisiológicos, incluindo factores circulantes como por exemplo hormonas e factores de crescimento semelhantes a insulina. Estudos clássicos sugeriram pela primeira vez, atraves de experiências de transplantação em membros de salamandra, que os órgãos podem possuir informação intrinseca sobre o seu tamanho final, mas o mecanismo subjacente continua por identificar. Recentemente, foi descoberta a via de sinalização Hippo, uma cascata de cinases que culmina na regulação de um potente regulador do crescimento. Por isso, esta via tem-se vindo a afirmar como um dos mecanismos regulatórios mais pertinentes na abordagem da questão do controlo do crescimento. A via Hippo foi descoberta inicialmente em Drosophila melanogaster como uma potente cascata de fosforilação que envolve simultaneamente a coordenação da proliferação celular e da apoptose durante o desenvolvimento. Posteriormente, foi demonstrado que existem vários homólogos directos dos seus componentes em mamíferos e que a via assume um papel semelhante, indicando que esta altamente conservada ao longo da evolução e que pode funcionar como um mecanismo global de regulação do crescimento em Drosophila e em vertebrados. Os primeiros componentes desta via foram identificados em rastreios genéticos em Drosophila que tinham como objectivo encontrar genes supressores de tumores, aqueles que quando mutados com perda de função induzissem um crescimento exagerado dos tecidos. Os primeiros genes a serem identificados foram warts (wts) e salvador (sav), dois genes supressores de tumores, cujas proteinas interagem entre si. Foi demonstrado que a perda de função de qualquer um destes genes resulta num aumento da proliferação celular e redução da apoptose, o que constituiu a primeira evidencia de regulação destes processos por estes componentes. Um passo decisivo na descoberta desta via de sinalização foi a identificação do gene hippo (hpo), o terceiro componente em Drosophila. Este gene, e consequentemente a via, acabaram por ser chamados de hippo uma vez que quando esta mutado, o seu fenótipo é caracterizado por várias dobras de tecido com crescimento excessivo, fazendo lembrar as dobras na pele do hipopotamo. Até agora, já foi identificado um grande número de componentes da via, tanto em Drosophila como em mamíferos, fazendo emergir uma complexa rede de reguladores positivos e negativos, que foi dividida em três grandes grupos: os componentes centrais e os componentes a montante e a jusante dos componentes centrais. Em Drosophila, o grupo dos componentes centrais é formado pelas cinases Hpo e Wts, e pelas proteinas adaptadoras Sav e Mats, que interagem entre si, estabelecendo uma cascata de fosforilação. Quando a via é activada, a cascata de fosforilação inibe o co-activador de transcrição Yorkie (Yki), que quando fosforilado, fica retido no citoplasma sem conseguir migrar para o nucleo e activar a transcrição dos seus genes-alvo. Por outro lado, quando a via está inactiva, Yki não é fosforilado e é transferido para o núcleo, onde se liga a diferentes factores de transcrição, promovendo a expressão de genes especificos, que induzem a proliferação celular e inibem a apoptose. Desta forma, a sobreexpressão de yki induz um sobre-crescimento nos tecidos, mediado pela transcrição activa dos seus genes-alvo, o que faz com que este gene actue como um oncogene, enquanto os outros membros nucleares actuam como supressores de tumores, inibindo a sua actividade. Em mamíferos, foi demonstrado que todos os componentes nucleares da via identificados na mosca tem homólogos directos como Mst1/2 (homólogos de Hpo), Sav1 (homólogo de Sav), Lats 1/2 (homólogos de Wts); MOBKL1 A/B (colectivamente denominado Mob; homólogos de Mats) e dois co-activadores da transcrição YAP e o seu parálogo TAZ (homólogos de Yki), e que interagem entre si da mesma forma descrita anteriormente em Drosophila. O Peixe-zebra (Danio rerio), e um organismo frequentemente usado como modelo vertebrado para o estudo do desenvolvimento, uma vez que possui diversas caracteristicas atractivas, como o rápido desenvolvimento, facil reprodução e manutenção, e oferece varias possibilidades em termos de ferramentas genéticas, como por exemplo a criação de linhas transgénicas. Adicionalmente, o peixe-zebra é um modelo muito usado no estudo da regeneração pois, à semelhança de outros vertebrados inferiores, apresenta um grande potencial regenerativo, na medida em que consegue regenerar um elevado numero de tecidos, tal como a retina, o coração, a espinal medula, as escamas e todas as barbatanas. Em particular, a barbatana caudal e uma das estruturas de eleição para o estudo da regeneração, pois pode ser facilmente acedida para efectuar uma amputação e danificada sem comprometer a sobrevivência do animal. Além disso, após amputação, a barbatana caudal tem a capacidade de recuperar o seu tamanho entre 7 a 14 dias. É de salientar, que independentemente do número de amputações ou outros factores externos, a barbatana recupera sempre o mesmo tamanho original, o que sugere a existência de um mecanismo altamente controlado que determina o tamanho correcto da estrutura a regenerar. Tendo em conta o curto espaco de tempo que este processo regenerativo necessita para ficar concluído, existe um aumento significativo da proliferação celular, mas que ocorre de forma controlada. Um dos factores que determina essa taxa de proliferação diz respeito ao local de amputação, sendo que quanto mais proximal for o tecido amputado, ou seja, quanto mais tecido for amputado, maior será a taxa de proliferação e consequentemente mais rápida será a regeneração do tecido. Esta propriedade reflecte um mecanismo ao qual se chama memória posicional, que permite ao organismo reconhecer e regenerar apenas as estruturas/tecidos removidos na amputação. Dadas as potencialidades da via Hippo ao nivel da regulação do crescimento, esta apresenta-se como um bom candidato para abordar o estudo da regeneração no peixe-zebra. A sua grande conservação entre espécies já demonstrada nos diferentes modelos, faria prever que a via estivesse também presente no peixe-zebra, sendo este evolutivamente mais próximo dos mamíferos do que da mosca. Até agora, já foi evidenciado que alguns componentes tais como Mats, YAP e Lats estão conservados, no entanto, pouco se sabe ainda sobre as funções fisiológicas desta via neste organismo. Para mais conclusões, será necessário efectuar uma análise mais completa. Tendo em conta todos estes dados, este projecto tem como principal objectivo ajudar a perceber qual o mecanismo que regula o processo de regeneração na barbatana caudal do peixezebra, que permite à barbatana recuperar sempre o seu tamanho original. Para tentar responder a esta questão, uma das mais antigas na area da Biologia Regenerativa, fomos estudar o possivel envolvimento da via Hippo na regulação do tamanho final durante a regeneração. Nesse sentido, foi efectuada uma analise que abrange diversos componentes da via, atraves do estudo da expressão génica por hibridação in situ e RT-PCR não quantitativo. Esta análise permitiu-nos observar que vários componentes da via estão efectivamente a ser expressos durante a regeneração e os nossos resultados sugerem que a via Hippo pode desempenhar um papel importante na regulação deste processo de reparação. A via Hippo pode mesmo ser o regulador central que coordena o processo de crescimento da barbatana durante a regeneração, fornecendo as células sinais de proliferação ou apoptose, permitindo uma constante manutenção do tamanho da barbatana após amputação.
The Hippo pathway is a recently discovered signaling pathway that has been shown to be a potent growth regulator, whereas its deregulation leads to dramatic tissue overgrowth. This pathway is highly conserved throughout evolution, since its components are present and have direct homology between Drosophila and mammals, indicating this pathway as a potential universal mechanism of growth control. This topic is of outmost interest since the mechanisms by which the organism controls growth to obtain its final size remain as a long-standing question in Developmental Biology. Zebrafish (Danio rerio), a vertebrate model frequently used in the study of development due to its several advantages such as the possibility of generating transgenic lines, has direct homologs to some of the components of the Hippo pathway, although the conservation of their function has not been shown. Additionally, zebrafish has a great capacity to regenerate several structures, such as the fins. The caudal fin is typically used to assess regeneration, since upon amputation it fully recovers the lost appendage with full functionality and restoring the original size, after 7-14 days. The original and final size of the fin is always restored regardless of the number of times it is amputated, which suggests the existence of a strict mechanism regulating growth during this repair process. Therefore, the Hippo pathway seems to be a promising approach to help understanding how the growth and final size are regulated during epimorphic regeneration. In this work, we perform a broad and systematic analysis of several components of the pathway and show that most of them are effectively expressed in the fin during regeneration. Our data thus suggest that the Hippo pathway might be one of the key regulators of size maintenance upon injury, instructing the cells with proliferation or apoptotic cues, a long-lasting question in the field of Regenerative Biology.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011
URI: http://hdl.handle.net/10451/4539
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