Modulation of y-aminobutyric acid (GABA) uptake by P2Y1 metabotropic purinergic receptor in rat cortical astrocytes

Abstract

Os astrócitos expressam uma variedade de receptores purinérgicos (P2), envolvidos na comunicação entre astrócitos e indutores de aumentos rápidos na [Ca2+]i. Os receptores metabatrópicos do ATP (P2Y) regulam o Ca2+ citoplasmático através da via de sinalização PLC-PKC, a qual está, também, envolvida na regulação da actividade dos transportadores de GABA, nomeadamente GAT-1 e GAT-3. No presente estudo foi analisada, a modulação dos transportadores de GABA nos astrócitos pela breve activação dos receptores P2Y e os seus aumentos de Ca2+ concomitantes. Foram realizadas experiências, de imagiologia de Ca2+, para caracterizar funcionalmente os subtipos de receptores P2Y, expressos em culturas corticais primárias imaturas (11-15 dias de cultura) e maduras (21-25 dias em cultura) enriquecidas em astrócitos. Realizaram-se ensaios, de recaptação de [3H]-GABA, para avaliar se os agonistas moduladores de Ca2+ afectam a actividade dos transportadores de GABA em astrócitos. Neste trabalho demonstrou-se que, tanto astrócitos imaturos como maduros expressam funcionalmente receptores P2Y, sendo o receptor mais preponderante, o P2Y1. Incubação com ATP (100 μM) durante um minuto inibe a actividade dos dois transportadores de GABA analisados. O efeito inibitório foi reproduzido, na presença da adenosina deaminase e pelo agonista específico dos receptores P2Y1,12,13 (2- MeSADP). A inibição verificada na presença de 2-MeSADP é perdida, com os antagonistas dos receptores P2 (PPADS) e P2Y1 (MRS2179). O efeito do 2- MeSADP é também perdido, com a incubação com U73122, inibidor da PLC, mas não com GF109203X, inibidor da PKC, indicando que este efeito é mediado por um mecanismo dependente da PLC. A inibição dos GAT está também associada aos rápidos aumentos do Ca2+ intracelular, induzidos por estes receptores. Concluí-se que, uma activação breve dos receptores P2Y1 em astrócitos maduros induz aumentos intracelulares de Ca2+ e inibe os GAT em astrócitos, sugerindo que, estas duas funções astrocitárias podem estar relacionadas no controlo dos níveis extracelulares de GABA.

Astrocytes express a wide variety of purinergic (P2) receptors, that are involved in astrocytic communication through fast increases in [Ca2+]i. Of these, the metabotropic ATP receptors (P2Y) regulate the cytoplasmic Ca2+ through the PLC-PKC pathway, which is also involved in the regulation of GABA transporters activity, namely GAT-1 and GAT-3. The present study analysed the modulation of GABA transport into astrocytes by the brief activation of P2Y receptors and their concurrent increases in cytoplasmatic Ca2+. Ca2+ imaging experiments were performed to functionally characterize the subtypes of P2Y receptors expressed in immature (11-15 days in culture) and mature (21-25 days in culture) primary cortical astroglial-enriched cultures. [3H]-GABA uptake assays were conducted to ascertain if the agonists that trigger Ca2+ increases affect GABA transporters activity in astrocytes. It is describe that both immature and mature astrocytes express functional P2Y receptors, with the P2Y1 receptor being the preponderant one. One min incubation with ATP (100μM) produced an inhibition on the activity of the two GABA transporters analysed. Inhibition was reproduced in the presence of adenosine deaminase and by a specific agonist for the P2Y1,12,13 receptor (2-MeSADP). The effect of 2-MeSADP was completely blocked when the cells were pretreated with general P2 (PPADS) and selective P2Y1 (MRS2179) receptor antagonists. Inhibition by 2-MeSADP was lost by incubation with the PLC inhibitor (U73122) but not by the PKC inhibitor (GF109203X), suggesting an involvement of the PLC pathway by a PKCindependent mechanism. GAT inhibition by P2Y1 receptors is also associated with the rapid increases in intracellular Ca2+ produced by the activation of these receptors. In conclusion, brief activation of P2Y1 receptors in mature astrocytes triggers Ca2+ increases and inhibits GABA transport into astrocytes, suggesting that the two main astrocytic functions can be related to control extracellular GABA levels.